实验一 蛋白质含量测定平时必备哦亲讲解.pptVIP

蛋白质含量的测定 引言 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是 临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药 物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进 行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 ? 目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性 质建立的一些蛋白质测定方法： ? 物理性质： 紫外分光光度法 。 ? 化学性质：凯氏定氮法、 双缩脲法 、 Lowry 法 等。 ? 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 ? 其他性质：荧光法。 二、比色法： 利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，测定蛋白质的含量，如双 缩尿法和 酚试剂法 （ lowry s method ）。 三、紫外分光光度法： 利用蛋白质对 280nm 紫外光有最大的吸光度而采用 一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来 测定蛋白质的含量 公式 : 每 g 样品中含氮克数 × 6.25 × 100 ? 掌握蛋白质含量测定的原理和方法 ? 学会标准曲线的绘制 ? 熟练使用分光光度计、紫外分光光 度计。 实验目的 （一） 双缩脲法 （二） Lowry 法 （三） 紫外分光光度法 实验内容 【实验原理】 ? 蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液 中能与铜离子形成紫色络合物（双 缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白 质的含量成正比，因此可用于蛋白 质的定量测定。 ? 但必须注意，此反应并非蛋 白质所特有，凡分子内有两个或 两个以上的肽键的化合物以及分 子内有 H 2 N — CH ＝ NH -CH 2 - NH2 等结构化合物，双缩脲反应 也呈阳性。 ? 【实验材料】 ? 1 ．分光光度计 ? 2 ．试剂 （ 1 ）标准牛血清清蛋白溶液 10 mg/ml （ 2 ）双缩脲试剂： 【实验方法】 ? 1. 取 12 支试管分成两组，编号，分别加入 0 ， 0.2 ， 0.4 ， 0.6 ， 0.8 ， 1.0 ml 标准牛血清清蛋白溶液 , 用水补足到 1ml 。 ? 2. 加入双缩脲试剂 4 ml ，混匀。室温放置 30 min 。 ? 3. 以管 1 （空白管）调零，在 540 nm 的波长下进行 比色，分别记录各管的吸光度读数。 ? 4. 取两组平均值，以蛋白含量为横坐标，光密度 值为纵坐标，绘制标准曲线。 ? 5. 用同样方法测定未知样品。 【 计算 】 ? 蛋白含量 722 型分光光度计的使用 ? （ 1 ）预热仪器 将选择开关置于“ T ”，打开电源开关，使仪器预热 20 分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定 时应将试样室盖打开，使光路切断。 （ 2 ）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波 长。 722 型分光光度计的使用 ? （ 3 ）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“ 100% ”的情况下， 尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“ 1 ”挡，灵敏度不 够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“ 0% ”和 “ 100% ”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。 （ 4 ）调节 T=0% 轻轻旋动“ 0% ”旋钮，使数字显示为“ 00.0 ”， （此时试样室是打开的）。 722 型分光光度计的使用 ? （ 5 ）调节 T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿 放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上， 调节透过率“ 100% ”旋钮，使数字显示正好为“ 100.0 ”。 722 型分光光度计的使用 ? （ 6 ） 吸光度的测定 将选择开关置于“ A ”，盖 上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光 度调节旋钮，使数字显示为“ .000 ”。将盛有待 测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内， 盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶 液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的 吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。 重复上述测定操作 1-2 次，读取相应的吸光度值， 取平均值。 ? （ 7 ）浓度的测定 选择开关由“ A ”旋置“ C ”，将已标定浓度的样 品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放 入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。 （ 8 ）关机 实验完毕，切