基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 .ppt

步骤二：TALEN表达质粒构建 具专利保护的克隆构建系统 将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 X 2 真核表达TALEN质粒对 步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。 FOKI 内切酶打断靶点区 内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。 突变体形成 PCR – 酶切法 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。 经验规律：= 2%可用，=10%很好 TALEN切割效率检测 TALEN切割效率检测 启动子 – ABCDEF – stop-Target site - DEFHIJK 启动子 – ABCDEFHIJK 共转染 荧光素酶检测质粒 + TALEN质粒 1 + TALEN质粒 2 荧光素酶检测法 发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。 有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。 突变体筛选 有限稀释法获得单细胞克隆 PCR-酶切法鉴定 PCR测序确认 基本工具质粒 14 – 18bp靶点序列 怎样做TALEN 1单元模块质粒：A，G，C, T共4种 2单元模块质粒：4X4=16种 TALEN表达载体：基于PCS2质粒2种 怎样做TALEN 康 为 T A L E N 定 制 质 粒 产 品 1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择 2单元模块质粒 共16种选择 pCS2 TALEN真核表达载体 TALEN空载体2种/套 1+2单元模块质粒套装 4+16+2共22种质粒/套 多单元模块质粒 20以下任意单元数目 pCS2 TALEN真核表达质粒 将指定TALEN模块插入pCS2 TALEN真核表达载体 怎样做TALEN 康 为 T A L E N 技 术 服 务 TALEN质粒构建 提供两个测序证明的14-18碱基TALEN识别域真核表达克隆(pCS2)。且以293T细胞系转染，PCR酶切鉴定，灰度扫描定量证实突变效率高于10% TALEN靶向敲除细胞系构建 提供经克隆测序证明的目标基因移码突变细胞系(杂合子） TALEN靶向敲除斑马鱼构建 提供目标基因基因移码突变F1斑马鱼（杂合子） TALEN技术成功率影响因素 重组TALEN模块与靶位点的 ‘亲合力’ 靶点序列设计原则来自20个天然TLAE的统计规律 细胞系固有特性 K562容易，293中等，MC-10困难 细胞转染效率 不同细胞系转染效率不同，293高， HeLa低 所期待的目标 Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？Selection marker insertion？ TALE技术应用范围 细菌：尚无报道，已另有多种高效靶向技术。 真菌：有报道，TALE原理可行。 植物：TALE原理发现于植物，需特定转基因技术。 动物细胞：TALE原理可行，各细胞系效率不一。 斑马鱼：有TALEN基因敲除报道，尚无点突变与敲入报道。 小鼠、大鼠……原理肯定可行，但尚无报道（技术太新，转基因动物构建实验周期较长）。 TALEN应用扩展的技术关键： 切实可靠的表达系统。 高效的转基因及克隆筛选技术。 TALEN的植物应用 Ting Li et. al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology 背景 水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)导致细菌性白叶枯病。 细菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 与水稻Os11N3基因 启动子结合，调控（hijack）此基因上调表达，促进细胞内