（优质医学）western-blot-蛋白质的电泳分析.pptVIP

5、放好转膜夹，黑色面放在下面，放入纤维衬垫，在纤维衬垫上放置滤纸（厚的一张，薄的三张）轻轻地将凝胶放在滤纸上，用滚轴赶去气泡。 6、接着小心地将印迹膜放在凝胶上，并确保凝胶和印迹膜的位置正确，放置后尽量不要移动转印膜，以防止产生玷污印迹和人为印迹。除气泡，使凝胶和印迹膜完全地接触。 7. 在转膜液中浸润另外一张滤纸，将其放在膜上。 8、浸润另一块纤维衬垫，并将其放在滤纸上 9、扣好凝胶转印夹，做好标记，将其垂直插入缓冲液槽中，确定转印夹黑色面对应于黑色电极将夹子放在槽中，接通电源，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。按100v恒压在冰浴中转膜，注意监测电流的大小，并作好记录 10、转印结束后，取下转印夹，拆卸凝胶三明治装置，TBST 清洗印迹膜。 11、半干转时，顺序是滤纸-PVDF膜-胶-滤纸。 注意：如果发现转印夹夹不紧可，多垫滤纸，使其夹紧，否则影响转膜的均匀度。 * 注意： 1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸=膜=胶。 2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 4）整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。上下滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。 * * 转膜完胶不要扔，可置于考马斯亮蓝染色液中进行染色，看转膜效率，一般胶上蛋白 至少应有80％转至膜。 * 通过观察胶上蛋白是否残留及膜上marker蛋白颜色的深浅来判断转膜是否可以。 * 取PVDF膜，做好标记。 * 前期摸索大分子量时间时也可以放两张膜，检查转是否穿透。 * 转膜完的膜先用TBS漂洗，5 min X2。 * 丽春红 可逆染色 与下游WB检测完全相容，无任何干扰 蛋白质预染 Markers 实时监测 分子量参照 * 去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 -3h，或者4℃孵育过夜. 　 　　一般磷酸化蛋白不用脱脂奶粉封闭，而选用 　　3%－５%BSA。 糖蛋白有拖尾现象，最好用BSA来封闭 * 试剂 膜 浓度 备注 明胶 NC 1-3% 明胶加热溶解 脱脂奶,BLOTTO NC,PVDF 0.5-5% PVDF所需浓度要高 BSA NC,PVDF 1-5% PVDF所需浓度要高 TWEEN20 NC 0.05-0.3% 可能有杂带 * 抗 体 检 测 4 * 单抗 多抗 * 多克隆抗体 单克隆抗体 来源 小鼠，大鼠，兔子，羊等 鼠源性，兔源性 特点 来源广泛，制备容易 纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应 * 将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色 缺点：要求抗体浓度高，每种一抗均需用酶来标记 * 将标记物标记在二抗上 优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 * 抗体的选择 一抗的选择：合乎你抗原的应用种属； 方法上适于做 western blot； 单克隆抗体 二抗的选择：与一抗相抗； HRP标记 * 一抗孵育: 拿出合适大小的密封袋，写下抗体名称和日期及类型，配制一抗按1：1000 溶于一抗稀释液中，将膜从封闭液中拿出，注意只能夹没有蛋白的边缘部位，放置到一抗中，赶出气泡，4度摇床过夜（一般10-15h)，一抗回收4℃保存， 可用约10天左右。 洗膜：用TBST漂洗5 minX3次 二抗孵育： CST: 用1:2000，溶于二抗稀释液中中，孵育1 h（常温摇床） Pierce 分装：建议1:5000-1:100000。 Abmart：1:3000~1:8000 洗膜：TBST漂洗5 minX3次；最后用TBS 漂洗5 min。 注意： 1、避免膜干燥。 2、二抗要跟一抗相抗。 免疫反应 * 问：1、如何判断二抗是否有问题及如何快速摸索最佳二抗浓度？ 采用斑点法。 2、如何摸索一抗最佳浓度？ * 化学发光成像 1、打开仪器预热(提前30分钟），暗箱底座擦干净，铺上保鲜膜，保鲜膜下适当加点水使贴住。 2、打开电脑中的Image Lab程序-新建-选择-印记-chemi-设置（图像时间）-放置凝胶，调整大小及位置。 2、关闭电灯，按1：1取等量的ECL发光液（A、B两液）混合配置化学发光液，现配现用。（注意不能有遗漏的地方，