法学第五章 分子荧光分析法.pptVIP

930 型荧光计光路示意图 激发滤光片 发射滤光片 ? 第二节 荧光分析仪器 一 . 主要组成及部件的功能 荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图 光源 氙 灯 激发单色器 样品池 光电倍增管 数据处理 仪器控制 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 发射单色器 问题： 荧光分光光度 计与紫外 - 可见分光光 度计有何异同点？ ? 荧光分析仪器的主要部件 ? 激发光源： 汞灯、卤钨灯、氙灯、 ? 分光系统： 滤光片（两个）、单色器（光栅） ? 样器池： 低荧光材料或石英材料，四面透光 ? 检测器： 紫外 - 可见（光电倍增管） ? 显示系统 ：指针式、数字式及计算机显示 二、荧光分析仪器的类型 ? 1. 荧光光度计 ? 2. 荧光分光光度计 ? 荧光分光光度计 荧光分光光度计结构示意图 ? 分光系统： 光栅 ? 用途： 测定 激发光谱 、 荧光光谱 及 定量分析 。 ? 最大激发波长 l ex max 和最 大荧光波长 l em max 是鉴定物 质的依据和定量测定时最 灵敏的条件。 激发单色器 发射单色器 ? 荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外 - 可见分光光度计 荧光分光光度计 光路 光源 仪器 校正 吸收池 入射光与吸收光 同方向 入射光与荧光垂 直方向 两种光源 ( 紫外 + 可见 ) 一种光源 ( 紫外 ) 空白溶液 (F=0) 荧光对照品溶液 (F=100% 或 50%) 空白溶液 (T=100%) 紫外无吸收 两面透光 低荧光材料 四面透光 紫外 - 可见分光光度计 : 光源 样品池 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 荧光 ( 磷光 ) 分光光度计 : 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 紫外 - 可见分光光度计 测量池 ( 吸收池 ) 荧光分光光度计 样品池 I 0 I t I 0 I t I F,p 第五章 分子荧光分析法 1. 分子荧光分析分析法的基本原理（了解） 3 . 影响荧光强度的因素（熟悉） 2. 分子荧光分析仪器的结构及类型及新技术（了解） 4. 分子荧光分析法的基本概念、荧光光谱、 激发光谱、定量分析的依据（掌握） 发光分析法 ： 物质吸收一定能量后跃迁到激发 态，激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基 态的现象所建立的分析方法。 光致发光： 以光能激发而产生的发光 荧光和磷光 光照、加热、化学反应、生物代谢等 荧光分析法 ： 利用物质的荧光谱线位置及其强 度，对物质进行定性和定量分析的方法。 定性鉴别： 由于不同的物质其组成与结构不 同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同。 定量分析：如果该物质的浓度不同，它所 发射的荧光强度就不同。 1. 根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光 2. 根据激发光的波长范围分类： 紫外 - 可见荧光、红外荧光、 X 射线荧光 荧光分析法分类 荧光分析法特点 ： 灵敏度高、选择型好、样品用量少、操作简便 第一节 基本原理 一、分子荧光的产生 1. 电子激发态的多重度 电子激发态的多重度： M =2 S +1 S 为电子自旋量子数 的代数和 (0 或 1) ； 大多数有机分子的基态处于单重态； 2. 激发态 → 基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁 ( 发光 ) 和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 荧光 磷光 内转移 外转移 系间跨越 振动弛豫 无辐射跃迁 S 2 S 1 S 0 T 1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ? 2 T 2 内转换 振动弛豫 非辐射能量传递过程 振动弛豫 ： 同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间 10 -12 s 。 内转换 ： 同多重度电子能级中 , 等能级间的无辐射能 级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。 非辐射能量传递过程 外转换 ： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生 相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越 ： 不同多重态 , 有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋 — 轨道耦合进行 辐射能量传递过程 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l ‘ 2 l 2 l 1 荧光 ： 10 -7 ～ 10 -9 s , 第一激发 单重态 的最低振动能级 → 基态 ； 磷光 ： 10 -4 ～ 10s ；第一激发 三重态 的最低振动能级 → 基态 ； 二、激发光谱与荧光 ( 磷光 ) 光谱 固定荧光波长 ( 选最大激发光波长 ), 化