包涵体的纯化.ppt

包涵体的纯化;一、包涵体的定义 ;二、包涵体形成的原因; 1 、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。; 2 、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3 、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 ; 5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。 6 、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 ;三、包涵体表达的有利/有害因素： ;;四、包涵体破菌、分离、洗涤、溶解 ; 用超声波破碎法在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 此外还有高速组织捣碎法，玻璃匀浆器匀浆 ，反复冻融法 ，化学处理法 。 ; 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次??另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 ;2 、分离 5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。;3 、洗涤 包涵体沉淀中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成分，如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。由于这些脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤。洗涤常用低浓度的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持原结构。 ;也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质，这一步很重要，因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。;;4 、溶解 变性蛋白只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。包涵体的溶解主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 。 ;;;; 蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前使用比较广泛。 盐酸胍成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。 也可用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。;; 对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没