实训 细菌内毒素检查.docxVIP

实训二十一 细菌内毒素检查 一、实验目的 1．学习《中国药典》2005年版二部附录热原检查方法。 2．能够正确判断热原检查结果。 二、实验指导 《中国药典》现行版规定热原检查采用家兔法和细菌内毒素检查采用鲎试验法。 (一)热原检查法 由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。 《中国药典》现行版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。供试验用家兔应按药典要求进行选择，以免影响结果。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001ug/ml，试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。 (二)细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。 鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml 比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法。 细菌内毒素测定仪 三、仪器、试剂 仪器：注射器、烧杯、蒸发皿等 试剂：鲎试剂、细菌内毒素标准品、细菌内毒素检查用水、5%葡萄糖注射液 四、实验内容 1．实验准备 试验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰细菌内毒素的检查。试验操作过程应防止微生物的污染。 2．检查法 取装有鲎试剂安瓿5支，用0.1ml的细菌内毒素检查用水复溶后，其中2支加入0.1ml按最大稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，1支加入0.1ml用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成的2.0λ浓度的内毒素溶液作为阳性对照管，1支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管，1支加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用被测供试品溶液将同一支(瓶)细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液]作为供试品阳性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃适宜恒温器中，保温60±2分钟.保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 3．判断结果 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。供试品管2支均为(-)，应认为符合规定；如2支均为(+)，应认为不符合规定；如2支中1支为(+)，1支为(-)，按上述方法另取4支供试品管复试，4支中1支为(+)，即认为不符合规定。阳性对照管为(-)或供试品阳性对照管为(-)或阴性对照管为(+)，试验无效。 五、实验结果 1．将细菌内毒素检查法所得结果记入表1 表1 细菌内毒素检查法结果记录 品名 批号 试验日期 检品管1 检品管2 阳性对照管 阴性对照管 供试品对照管 鲎试剂 1支 1支 1支 1支 1支 内毒素检查用水 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.2ml 样品溶液 0.1ml 0.1ml 0.1ml 内毒素标准品溶液 0.1ml 0.1ml 现象 2．实验结果判断 本批号________________注射液，细菌内毒素检查法检查结果： 。 六、分析与讨论 1．对于内毒素限值的确定，药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量(亦称致热阈)，它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。M为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。 2．原则上一般根据药品使用说明书来确定最大剂量。通常以一次剂量为准，如注明2小时，则除以2，否则均以1小时为准；不足1小时的，也以1小时计；如未给出一次剂量，而是一日剂量，如一日2～4g，分2～4次用，这种情况以