GBT 杨树枯萎病菌检疫鉴定方法.pdfVIP

ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 中华人民共和国国家标准 杨树枯萎病菌检疫鉴定方法 Detection and Identification of Enterobacter cancerogenus (Urosevi) Dickey et Zumoff 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 I 杨树枯萎病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了杨树枯萎病菌（Enterobacter cancerogenus (Urosevi) Dickey et Zumoff ）的检疫鉴定方 法。 本标准适用于进出境苗木、原木等植物及其产品中杨树枯萎病菌的检疫鉴定。 2 杨树枯萎病菌基本信息 学名：Enterobacter cancerogenus (Urosevi) Dickey et Zumoff 异名：Erwinia cancerogena Urosevic 1966 英文名：Canker and dieback，Canker of poplar 中文别名：生癌肠杆菌 杨树枯萎病菌的其他信息见附录 A 。 3 分类地位 杨树枯萎病菌属细菌域 Bacteria ，变形菌门 Proteobacteria ，γ-变形菌纲 Gammaproteobacteria，肠 杆菌目 Enterobacteriales ，肠杆菌科Enterobacteriaceae ，肠杆菌属Enterobacter ，生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus 。 4 方法原理 杨树枯萎病菌主要通过带病的树干、树枝等传播，其症状特点、培养性状和生理生化特征、PCR 特异性鉴定结果是该病菌的鉴定依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、Biolog 仪、显微镜、高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作 台、高压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、pH 计、旋涡振荡器、微量可调 加样器（2.5 μL 、10 μL 、20 μL 、100 μL 、200 μL 、1000 μL ）等。 5.2 试验用具 剪刀、灭菌解剖刀、手持放大镜、全钢大号指甲钳、玻璃棒、接种环、镊子、培养皿、酒精灯、三 角烧瓶、量筒、离心管、滤纸等。 6 试剂和培养基 1 6.1 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR 反应体系用双蒸水。其他试剂比如 各种溶液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录要求准备。商品化试剂参见其使用说明。 70%酒精（Ethanol ）、乙醇（Ethanol ）、1%次氯酸钠（NaClO ）、CTAB缓冲液（Buffer CTAB ）、 TE缓冲液（TE Buffer ）、蛋白酶K （Proteinase K ）、氯化钠（NaCl ）、Tris饱和酚（Phenol Tris ）、三 氯甲烷 （Chloroform ）、异戊醇 （Isoamyl Alcohol ）、溴化乙锭 （EB ）、PCR Premix 、DL2000 DNA Marker 、 特异性引物、生理生化相关试剂。 6.2 培养基 营养琼脂培养基（NA ）。培养基配置方法及步骤见附录B 。 7 鉴定 7.1 症状检查 逐一对抽样产品进行症状观察。仔细观察树皮、树枝是否有溃疡斑或者开裂现象，树枝顶端是否产 生坏死。该病菌可导致树皮开裂，树枝顶端坏死。病菌侵染后，茎周围产生比较宽的开口或封闭的溃疡 斑或者数不清的裂缝，从而导致树皮脱落。感病品种在一定条件下产生的溃疡斑更深并且呈纵向排列。 疑似的病组织要带回实验室进行显微镜检查和病原菌分离。 7.2 病原细菌的分离纯化 选取产生症状的树枝等病组织，用流水冲洗干净、晾干，剪成小段