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分析方法的开发 分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、 流动相的选择、 检测波长的选择和梯度的优化几个方面。 目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。 1. 色谱柱的选择 原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻， 要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板 数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以 5um 填料的色 谱柱长要 250mm ，3.5um 填料的柱长要 150mm ，基本上都是各个粒径柱长最长的。喜欢近两 年新出的亚二微米填料的色谱柱， 50mm 柱长就能提供很高的理论塔板数， 而且柱长和粒径小了， 流速增加很多， 能节省很多的分析时间， 极大的提高工作效率。 一般选用直径为 4.6mm 或 3.0mm 的柱子， 太细了可能会增大柱外效应。 填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑， 普通的分析 柱都在 100A 左右，能满足分析检测的需要。对于 API 分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的 筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。 三种类型包括： 1) 普通的 C18 或相应的 C8 色谱柱，如 Waters 的 Symmetry C18 或 C8 ，YMC 的 Pack Pro C18 或 C8，Agilent 的 RX C8 等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱； 2) 封端处理的或者极性嵌入型色谱柱， 如 Waters 的 Symmetry Shield RP18 或 RP8 ，XTerraRP18 或 RP8 ，YMC 的 ODS AQ ，Agilent 的 Zorbax SB AQ 等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色 谱柱； 3) 填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。 一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异， 相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上 也会有差异， 这个主要是填料的性质和生产工艺决定的， 有时候用一只色谱柱分离不好， 除了优 化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个很好的选择。相同品牌型号的色谱柱， C18 和 C8 在选择性上没有差异，但是 C18 保留能力更强，相同的样品分离度更高，我们一般倾向于选 择用 C18 。我们在筛选色谱柱时尽量选择行业内排名前几位的厂家， 柱子品质好， 开发分析方法 时能省很多力气， 做出来的分析方法也有保证。 一个药从开发到上市可能会持续十几年甚至更长 时间， 厂家有实力， 开发方法时选定的柱子在若干年以后需要时还会有的买， 做分析时重复性也 能保障。 多用几只色谱柱做筛选和分析方法优化， 能尽最大的可能提高分析方法的质量， 保证检 测结果的可信度。 我比较喜欢用的柱子有： Agilent 的 Zorbax Eclipse XDB-C18 、Zorbax Eclipse Plus C18 ，Waters 的 Symmetry C18 、XTerra RP18 、XTerra MS C18 等， YMC 的柱子有时会是不错的备用选择， 菲罗门的柱子菲罗门的柱子国内外市场占有率较高，但是感觉柱子压力高，寿命短，尽量不用， 热电的柱子用的也不少， 但没什么感觉。 制剂分析方法选择色谱柱的要求基本和 API 相一样， 对 于中间体和生产过程中反应跟踪（ IPC ）分析方法开发使用的色谱柱，一般会根据样品性质直接 选取一两只普通 C18 或者封端处理过的色谱柱，简化筛选过程。 2. 流动相的选择 常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈， 甲醇有其性价比