萤光是一种光放射现象,当一个适当波长的光照射具有萤光性质的分.docVIP

◎螢光是一種光放射現象，當一個適當波長的光照射具有螢光性質的分子，分子會吸收光的能量而被激發至高能量狀態，並在極短時間(10-8-10-4秒)內，分子即回復低能量狀態，同時以放光的形式將多餘能量釋出，此即為螢光。依照所使用的激發光源可區分為傳統光源激發螢光及雷射激發螢光兩種。 ◎傳統光源激發螢光(Conventional Lamp Induced Fluorescence) 最早於1981年由Jorgenson和Lukacs提出，當用的傳統光源有汞、氘等電弧燈，首先以濾光片自發射光帶中分離出所需的波長，再經過聚焦來波發分子，產生螢光，由於傳統光源皆為連續波長發射的光源，故必需利用濾光皮或單光器來分離特定的波長，大幅降低激發光的入射光強度而同時也就限偵測的靈敏度質偵測極限一般在10-5-10-8M左右。 ◎雷射激發螢光(Laser Induced Fluorescence, LIF) 與傳統光源比較，以雷射為激發光源的靈敏度較高，因為雷射具有高強度，帶寬窄及同調性的特點，所以容易以透鏡聚焦，其單位面積上的強大能量，能有效提高靈敏度，些種偵測方式稱為雷射激發螢光，文獻上曾報導目前電射激發螢光的最低偵測極限可達10-21mol。 ◎代表性光學光路 1.非相干光源CE螢光檢測器 光束入射單色儀之前先通過紅外輻射濾波器 (水柱) ，用於吸收紅外輻射，保護單色儀不至因過熱受損。該螢光檢測器使用了雙單色儀，輸出波長可在200nm和800nm之間連續可調。因此，可根據需要選擇波長，是它的一大優點。此外，雙單色儀比通常採用的濾光片可選擇更窄的帶寬，減少散射光。但和雷射光源相比，其光強較弱，激發效率低。 2.共焦型LIF檢測器 共焦結構的特點是將樣品和狹縫精確地放在高數值孔徑(Numerical Aperture, N.A.) 物鏡的兩個焦點上，把樣品區帶的螢光成像在狹縫上，精確地調整狹的位置和大小，就可以有效地剔除管壁的螢光干擾。 3.雷射誘導螢光顯微鏡 採用前照明微鏡結構，通過同一物鏡收集螢光發射，採用二向色反射鏡分離螢光和反射光。 4.軸向激發CCD成像檢測的LIF檢測器 用CCD作CE的LIF檢測有許多優點，與最好的PMT相比，它的內電流低，量子效率高，更主要的是它有兩維模式。但是，CCD的讀取速率低，在通常的CE檢測中有可能漏峰或不能作定量分析。為了提高CCD檢測靈敏度，同時避免漏峰檢測，採用軸向激發和CCD的時延遲積分模試式具有一定優越性。雷射從毛細管出口端聚焦入射，照明2cm區段，在此區段的分離組被激發產生螢光，收集後成像在CCD上。 ◎激發波長選擇 波長的選擇必須與待測樣品的吸收光譜匹配。如果用同一衍生試劑標記，就可選擇到最佳波長，對常規光源，可用激發濾光片或單色儀來選擇波長，雷射的波長選擇範圍有限，除了可調諧的染料雷射外，一般雷射只輸出固定的一個波長或分立的幾個波長，這是激光光源不足之處。因此，在LIF情況下，就需要從雷射可能輸出波長和化合物衍生試劑的吸收波長兩個方面來考慮，作出恰當的選擇。 ◎樣品的螢光標記 螢光檢測有很高的靈敏度。可惜，大多數物質的螢光量子產額很低，或不發螢光，特別是感興趣的一些生物分子，如氨基酸和多數蛋白質等。因此，需要借助衍生(derivatization)或標記(labeling)技術，對不發螢光的樣品進行螢光標記。一些常用的螢光衍生試劑如下表所示： 試劑 激發和發射波長 反應物 螢光素異硫氰酸鹽(FITC)(fluorescein isothiocyanate) λex490nm λem519nm 氨基酸、多肽、蛋白質 螢光胺(fluorescamine) λex390nm λem450nm 伯氨基酸 9-芴基甲基氯甲酚酯(FMOC)(9-fluorenylmethyl chloroformate) λex260nm λem305nm 鄰苯二醛(OPA)(o-phthaldialdehyde) λex350nm λem450nm 氨基酸、多肽、蛋白質、胺 3-(4-羧基甲酰基)-2奎寧羰醛(CBQCA)[3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinoline] λex456nm λem552nm 氨基酸、多肽 萘二醛衍生物(NDA)(naphthalene-2, 3-dicarboxyaldehyde) λex442nm λem490nm 4-chloro-7nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole λex470nm λem530nm 伯胺、仲胺 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid succinimidyl ester(DCCS) λab437nm 氨基酸 λex為激發波長 λem為發射波長