荧光定量PCR原理及其应用.ppt

@ 荧光定量PCR的原理及其应用 分子生物学实验技术 @ 大纲 .原理概述 二.操作及结果分析 (一).样品制 (二).引物及探针的设计与合成 三).标准品的制备一质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程 三.应用 (一).绝对定量分 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析 原理概述 @@ 1.Rea1- Time pcr概论 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国App1 ed Biosystems公司推出 该技术不仅实现 PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决FCR污染问题 自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用 实时荧光定量PCR:在PR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整 个PcR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 量PCR仪是在普通PR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置,PCR扩增和检测 同时进行,最终结果不需进行电泳检测,所以有效地避兔了样品间的交叉污染 常规PCR技术 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模板 实时检测 实时定量PCR技术:利用荧光信号的变化实时检测FCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化,通过ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 原理概述 @ 2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (1).扩增曲线:反映PR循环次数和荧光强度的曲线,定量PCR仪每次轮FCR扩增都会自动 录荧光强度的变化 焚光基 扩增曲图: 横尘耘:扩崤衢环数(cc 失光橋朗元件 每个循环进行一次荧光信号的收集 原理概述 @@ 2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (2).荧光阅值:样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,手动设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段,并且保证回归系数大于0.99 (3).C值:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。 c(t) value