第八章酵母基因工程详解.pptVIP

1 ）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因 GAPDH 磷酸甘油激酶基因 PKG 乙醇脱氢酶基因 ADH 酿酒酵母表达系统常用启动子 2 ）半乳糖激酶启动子（ GAL1 ） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A 、 GAL1 、 GAL7 和 GAL10 基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B 、 GAL4 产物与 UAS 结合，促进转录； GAL80 产物抑制 GAL4 产物的活性，阻遏转录 C 、野生型 GAL4 表达水平低，产物活性可被 GLAL80 产物完全抑制，半乳糖诱导效果差 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 2 ）半乳糖激酶启动子（ GAL1 ） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A 、 将 GAL4 的启动子换成 GAL10 的诱导型强启动子 B 、半乳糖诱导 GAL4 高表达，不受 GAL80 产物抑制，激活 GAL1 等高效转录 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 Promoter GAL10 3 ） pho4 TS -PHO5 启动子 A 、 PHO5 启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录 B 、 PHO4 基因编码产物是 PHO5 启动子的正调控因子 C 、 pho4 TS 温度敏感， 35 ℃时失活， PHO5 关闭 D 、 pho4 TS -PHO5 启动子通过 降温（ 23 ℃） 诱导表达 低温诱导、磷酸盐抑制 酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子： MF- α 酸性磷酸酯酶： PHO5 蔗糖酶： SUC2 杀手毒素因子： KIL 2 、酿酒酵母分泌系统 * 保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用 * 信号肽结构： 酿酒酵母信号肽特点 正电荷区 疏水区 极性区 Met 目的蛋白 信号肽剪切位点 * 分泌效率高 * 在酵母系统具有通用性 *88 个残基组成 MF- α 信号肽 Met 目的蛋白 -Lys-Arg- Glu-Ala - Glu-Ala - KEX2 DAP DAP DAP ： STE13 编码的二肽酶 糖基化位点： Asn-X-Thr/Ser （ X 代表任何氨基酸） N- 型糖基化： 天门冬酰氨酸 残基上的 酰胺氮 进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O- 型糖基化： 苏氨酸 / 丝氨酸 上的 羟基氧 进行糖基化 3 、酿酒酵母糖基化系统 真菌基因工程 三、甲醇酵母表达系统 二、酵母转化系统 一、真菌表达系统的优缺点 四、丝状真菌表达系统 一、真菌表达系统的优缺点 具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 FDA 认定为安全的 基因工程受体系统（ Generally Recognized As Safe GRAS ） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距 具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点 二、酵母转化系统 酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源 DNA 在酵母宿主中的命运 1 、酵母宿主系统 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作模式真核生物的酵母宿主菌 酿酒酵母（ Saccharomyces cereviasiae ）： * 无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物 * 繁殖方式与原核类似，易于操作 * 基因表达调控机理与高等真核类似 用作外源基因表达的酵母宿主菌 酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化 甲醇酵母： 可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理 毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris ） 汉逊酵母：多型汉逊酵母（ Hansenula polymorpha ） 其它酵母： 已有 60 多种酵母菌建立了转化系统 乳酸克鲁维酵母（ Kluyveromyces lactis ) 非洲酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe) 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 能抑制超糖基化的突变类型 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 och 外侧糖链添加缺陷型 突变类型 生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有 寡糖基团 ， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由 糖基核心 和 外侧糖 链 两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组