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大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1. 目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2. 范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3. 责任者 QC化验员。 4. 程序： 4.1. 简述 4.1.1. 大肠埃希菌 (Escherichia coli) 即大肠埃希菌， 为肠埃希菌科埃希菌属 的模式种。 埃希菌属除大肠埃希菌外， 新近发现有非脱羧埃希氏菌等 5 个种。大 肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌， 随粪便排出体外。 在药品中检出大肠 埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染， 即可能污染肠道病原体。 大 肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌， 可引起婴幼儿、 成人爆发 性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用 4- 甲基伞形酮葡糖苷酸 (4-Methylumbelliferyl- β -D-glucuronide ，MUG)和靛基质 (Indole) 试验检查大肠埃希菌是一项新技术， 其 检验步骤为：增菌培养后，转种 MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从 混合菌中分离单个菌，如 MUG、Indole 试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物， 产生颜色或荧光反应 作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明， 96％的大肠埃希菌含 β- 葡糖苷酸酶 ( β-glucuronidase ，GUD)， 约 10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。 MUG被 GUD水解，产生荧光， 由于荧光 反应的敏感度较颜色反应强千万倍， 易于观察， 没有主观性， 因而用 MUG鉴定大 肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的 MUG鉴别大 肠埃希菌其漏检率达 6 ％，鉴于 98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将 MUG与靛基质试验结合， 比单用 MUG可提高大肠埃希菌的检出率。 如 MUG与 Indole 试验的反应不一致时， 则需将供试液的增菌培养物用 EMB琼脂平板分离培养、 革 兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达 98 ％。 如仅用 IMViC 生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2. 仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱 (36 ±1℃) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2.5. 显微镜 (1500X) 4.2.6. 微波炉 4.2.7. 恒温水浴（ 45±1℃） 4.2.8. 离心机 (500 ～4000r/min) 4.2.9. 0.45 μm±0.02 μm薄膜及过滤器 4.2.10. 电冰箱 4.2.11. 匀浆仪 4.2.12. 366nm 紫外灯 4.2.13. 玻璃器皿、器具 4.3. 试液、指示液 4.3.1. 0.9 ％无菌氯化钠溶液 取氯化钠 9.0g ，加水使溶解成 1000ml，121℃ 灭菌 20 分钟。 4.3.2. 靛基质试液 取氯化二甲氨基苯甲醛 5.0g ，加入戊醇 ( 或丁醇 )75ml ， 充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸 25ml 徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热 导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛 1.0g