第五章沉淀2教学讲义.pptVIP

第五章; 沉淀(Precipitation)是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。 结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出； 沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。 沉淀法是一种初级分离技术，广泛应用于实验室和工业规模蛋白质等生物产物的回收、浓缩和纯化。 ; 优点：设备简单，成本低，原料易得，便于小批量生产；产物浓度越高，沉淀越有利，收率越高，浓缩倍数高;5.2 蛋白质特性;胶体：质点大小1～100nm；溶液：1nm 布朗运动：胶体粒子不停息的，无规则的运动，它是分子热运动的必然结果 丁达尔现象：光的散射 Pr溶液是稳定的胶体溶液： Pr表面的水化层 Pr表面具有同性电荷 沉淀方法： 破坏水化层 改变电荷性质 ;静电斥力;静电斥力;水化层厚度和ξ电位与溶液性质(如电解质的种类—浓度、PH值)密切相关，所以，蛋白质的沉淀可采用恒温条件下添加各种不同试剂的方法：加入无机盐的盐析法、加入酸碱调节溶液pH的等电点沉淀法、加入水溶性有机溶剂的有机溶剂沉淀法等。 ;原理 影响盐析的因素 盐析操作 ;盐析原理 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析(Salting-out)。当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度之间呈线性关系，用Cohn经验方程描述： ;蛋白质的水溶液逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用却加强，因而蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶(salting-in)。随着离于强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱，同时，由于盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，从而增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝聚，进而沉淀。 ;盐溶 盐析;无机盐 温度和pH值 ; 在相同的离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同，盐的种类主要影响 Cohn方程中的盐析常数Ks值。 在选择盐析的无机盐时，除考虑上述各种离子的盐析效果外，对盐还有如下要求： (1)溶解度大，能配制高离子强度的盐溶液； (2)溶解度受温度影响较小； (3)盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。 ;阴离子的盐析作用顺序为 P03—4S02—4CHC00—CI—N03—C104-I-SCN- 阳离子的盐析作用的顺序为 NH+4K+Na+Mg2+ 盐浓度增加，盐析效果好。 ; 温度和pH对蛋白质溶解度的影响反映在Cohn方程中是对β值的影响。 在高离子强度溶液中，升高温度有利于某些蛋白质的失水，因而温度升高，蛋白质的溶解度下降。 而在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。 ; 在pH接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶解度最小(β值最小)，所以调节溶液pH在等电点附近有利于提高盐析效果 。;加入方式: 直接加入固体硫酸铵（防止局部过浓） 加入硫酸铵饱和溶液（料液被稀释）;加入量计算: 1、由硫酸铵饱和度配制表查（手册） 2、固体加入量：;加入量计算: 3、饱和溶液加入量：;;盐析广泛应用于各类蛋白质的初级纯化和浓缩。 人干扰素的培养液经利用硫酸铵盐析沉淀，可使人干扰素纯化1.7倍，回收率为99％； 白细胞介素2(interleukin 2)的细胞培养液经硫酸铵沉淀后，回收率为73.5％，纯化倍数达到7.0。 盐析沉淀法还可用于蛋白质的高度纯化。 无血清培养基培养的融合细胞培养液加入等量的饱和硫酸铵溶液，得到的沉淀物中单克隆抗体回收率达100％，纯度达到电泳纯。 从牛胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可利用反复盐析沉淀并结合其他沉淀法(如后述的等电沉淀法)，可制备纯度较高的酶制剂。;1、由实验获得牛血清蛋白的溶解度当硫酸铵浓度为2.5及3.5mol/L时，该蛋白的溶解度分别为12及0.006g/L,试求当硫酸铵为3.0mol/L时，该蛋白的溶解度。（0.25) ; 利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法(Isoelectric precipitation)。 ;等电点沉淀的操作条件是：低离子强度(盐溶）；pH≈pI。 考虑产物的稳定性（如胰蛋白酶在等电点(10.1）处不稳定。 等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质。 与其它方法结合 ;优点：与盐析相比，后续无需脱盐 缺点：pI处，有些Pr会变性失活 ;从猪胰脏中提取胰蛋白酶原(pI＝8.9)时，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI≈3.0) 工业生产