西北农林科技大学-生物技术综合大实验.pdfVIP

生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（2012014069） 纪成功 孔令浩 王玉康 王鹏程 董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提 纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有 GFP 基因的原核表达载体到 BL21 表达菌株中，通过氨苄抗性筛 选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交 换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和 SDS 凝胶 电泳 检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了 GFP， 并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯 疏水层析 离子交换层析 凝胶过滤层 析 1. 介绍：GFP 最早是由下村修等人在 1962 年在一种学名 Aequorea victoria 的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色 波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为 27kd，有 238 各氨基酸基团］，三维结构为β 圆柱，圆柱两端由一些较短的α 螺旋盖住，圆柱中央是几段α 螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构 性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳 离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝 胶过滤层析逐级提纯 GFP。 2. 材料和方法 2.1. pGFP 质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP 基因表达由易受阿拉伯糖诱导 的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配） 提取。取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管，1000rpm 离心 30s，弃上清 ——加入 100μl 提质粒溶液 I，震荡混匀——加入 200μl 溶液 II， 温和混匀置至于冰上 5min——加入 150μl 溶液 III，混匀，置于冰 上 5min——1000rpm 离心 3min，转移上清于另一新 1.5ml 离心管， 加入 900μl 无水乙醇，混匀，室温静置 3min——12000rpm 离心 5min，弃上清，待其干燥——于 30μl TE 中溶解，冰上暂存。 2.2. 转化 取 1.5ml OD600 0.3~0.4 BL21，冰浴 30min——4000rpm 离 心 10min，弃上清——加入 200μl 0.1M CaCl2——悬浮沉淀，冰 浴 15min——4000rpm 离心 10min，弃上清——加入 200μl 0.1M CaCl2 悬浮沉淀，备用。取 1μl 质粒 DNA 加入制备好的感受态细 胞，温和混匀，置于冰上 30min——42°C 水浴锅，热击 45-60s——冰浴 10min——加入 900μl LB 培养基，37°C，150rpm 震荡培养 30min——涂板（LBp/ara），37°C 温育过夜。 2.3. 筛选重组子及扩大培养 将平板放置紫外灯下检测，标记，挑取绿色荧光单菌落，于 5mlLB （amp）培养基中 37°C、150rpm 震荡培养 7 小时—— 吸取 2ml 菌液，置于 200mlLB （amp/ara）培养基中，37°C、150rpm 振荡 培养过夜。本组的平板并无可视菌落，所以挑去他组菌落 2.4. 收菌破碎 收集菌液200ml 于250ml 离心管，共4 管，5000xg 离心 10min， 弃上清——每管 30ml 溶解缓冲液（50mM Tris-HCl，1mmol/L EDTA）重悬沉淀，将 4 管合并为 1 管——每管加入 60μl 溶 酶， 混匀 将离心管置于冰上，超声波破碎仪探头插入离心管，探头离 底部约 1cm 且不触离心管壁——900w ，超声 3s，静止 3s，共 8min，重复 3 次——7500xg 离心 15min，在紫外灯下观察沉淀（留 样）和上清（留样），取上清备用。 2.5. 盐析 取上清定容至80ml——取10ml做预实验——用溶解缓冲液 稀释至100ml——分装至10只试管，每管10ml——称取不同浓度 梯度(NH4) SO