2019年3新技术育种.pptVIP

? 1973 年科恩 (Cohen,S.) 等人进一步将酶切后的外源 DNA 片段与质粒 DNA 链接起来 , 构成一个重组质粒 (recombinant plasmid), 并将这个重组质粒转入大 肠杆菌细胞。这些开创性的工作为基因工程建立了 一套完整的方法和体系 , 成为现代生物学发展史上 的重要 里程碑 。 ? 人们能在分子水平上对微生物的初级代谢和次级代 谢生物合成中所涉及的各种基因进行深入的研究并 进行定向改造，从而大大推动了菌种改良的进程。 ? 通过重组 DNA 技术提高次级代谢产物产量的主要方 法包括 : ① 转座突变发生； ② 通过基因工程技术靶向删除和复制基因； ③ 通过原生质体融合进行基因重组。 基因工程菌操作程序 1 、原理和方法 ? 在一个微生物菌种的初级代谢和次 级代谢生物合成途径中，常常有少 则几个多至几十个基因参与，其中 一些编码了限速步骤的酶，这些所 谓的关键酶基因表达量的多少直接 与生物合成的速率有关。 ? 另外，抗生素等发酵产物的生物合 成途径中常会发生旁路代谢，产生 一些不需要的副产品或结构类似物， 这样，不仅造成生物合成代谢流能 量资源的浪费，而且还会对下游的 分离纯化和产品的质量带来一定的 影响。 S 底物 P 产物 B1 、 B2 副产物 ? 从育种的角度考虑， 最为重要的是基因的 高效表达。？？ – 因为目的基因被插入某种载体中，并不意味着 这个基因就会表达或能高效表达。 ? 因此，选择一个适宜的高效表达系统，才 能保证表达产物能够高效表达。 基因表 达系统 原核表达系统 真核生物表达系统 有酵母、丝状真菌等 目前常用大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、链霉菌等 ? 在众多与生物合成有关的基因中，有些属 调节基 因 ，调控了各种酶基因的启动和关闭，它们对最 终产物的合成往往是至关重要的。而大多数属 结 构基因 ，编码了一些酶基因，通过在一个微生物 中导入一些特定的外源酶基因，常常能给这个微 生物的生物合成增加新的功能，达到合成新化合 物的目的。 ? 方法 ：（ 1 ）通过基因克隆方法，交换或导入相关 基因，通过基因量的增加或调控基因能力的加强 提高微生物的合成能力；（ 2 ）通过阻断不需要的 旁路代谢途径增加主要途径的代谢流，从而达到 减少副产品，提高主要产量的目的。 原 核 生 物 基 因 表 达 的 调 控 乳糖代谢基因表达调控图解： ( 没有乳糖时 ) Ｒ Ｐ Ｏ lac Z lac Y lac A 调节基因 启动子 操纵基因 结构基因 RNA 聚合酶 信使 RNA 转录 翻译 阻抑物与 操纵基因 结合，结 构基因转 录受阻． 阻抑物 原 核 生 物 基 因 表 达 的 调 控 乳糖代谢基因表达调控图解： ( 有乳糖时 ) Ｒ Ｐ Ｏ lac Z lac Y lac A 调节基因 启动子 操纵基因 结构基因 信使 RNA 转录 翻译 阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变， 因而不能与操纵基因结合，使得结构 基因进行转录。 阻抑物 乳糖 转录 半乳糖苷酶 透过酶 转乙酰酶 乳糖分解代 谢调控过程 是一个自我 调控过程 RNA 聚合酶 建立合适的宿主和载体系统 —— 基因工 程菌的稳定性 ? 基因工程菌在传代中常出现 质粒不稳定现 象 。 ? 质粒不稳定可分为两种： – 分裂不稳定 ：是指基因工程菌分裂时，出现一 定比例不含质粒的子代菌。 – 结构不稳定 ：是指外源基因从质粒上丢失、碱 基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。 质粒不稳定的产生原因 质粒不稳定常见的是分裂不稳定 。 ? 主要与两个因素有关： 一是 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率。 二是 含质粒菌与不含质粒菌的比生长速率差异的 大小。 含低拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率高，因 此，增加工程菌中质粒拷贝数有利于提高质粒稳定性。 含高拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是 大量外源质粒的产生，造成含质粒菌比生长速率明显低于不 含质粒菌，所以一旦产生了不含质粒菌，能很快地取代质粒 菌，因此进一步提质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负