2019年常用中药的生物鉴定 PCR.pptVIP

After PCR amplification Agarose gel electrophoresis to check product 1.5% agarose in 17 ml TAE ( 4mm thick) 5 ul product add 1 ul 6X loading dye mix 1Kb marker 2.5 ul 100 V run 25-30 min EB stain 10 min ( EB 致癌物 , 戴手套 ) , photograph 1.5 1.0 0.5 0.2 Kb 10 gamma primer Mismatch 3 base 10 gamma primer complete match PCR 的应用 1.detection genetically modification organism (GMO ) 检测转基因生物，找出特异的基因或片 段 find specific gene or fragment (promoter) 2.uncultured microorganism 3.pathogen identification 4.detection insertion sequence (cloning) 提取模板 反应体系配置 PCR 扩增 电 泳 引物设计 常用中药的生物鉴定 之聚合酶链式反应 常用中药的生物鉴定方法 ? 免疫鉴定法 ? 电泳鉴定法 ? 生物效价鉴定法 ? 单纯指标鉴定法 ? 细胞生物学鉴定法 ? DNA 遗传标记鉴定法 ? mRNA 差异显示鉴定法 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) ， 简称 PCR ，是一种分子生物学技 术，用于放大特定的 DNA 片段。 可看作生物体外的特殊 DNA 复制。 少量 DNA 样品快速扩 增 amplify 技术。 (invented by Kary Mullis , won a Nobel Prize in Chemistry in 1993 ) 原 理 PCR 要 件 模板 Template 引物 Primers : Small pieces of DNA. Made up of 15 to 30 bases. Binds the DNA at a specific region . forward and reverse 正向和逆向 酶 Enzyme: Taq DNA polymerase PCR 核酸 Nucleotides: Substrate, four deoxyribonucleotides ( A , C , G , T ) dNTP M Dist H 2 O 117 ul 10X buffer 15 ul dNTP 12 ul Primer 1 3 ul Primer 2 3 ul Taq polymerase 0.75 ul 200ul tube Pipette 上下混合 取出 15 ul 剩下的加入 3 ul Template DNA 用 pipette 上下混合 分装入 tube 15ul/ 支 标上 1…….5 1 2 3 4 5 54 ° C 56 58 60 62 Run PCR Tc Tc 55 ° C 不加模板的对照组 M 加入 1 ul 模板 DNA 不加引物但有模板的对照 Pc 15 ul M TC 3 ul template (T) Pipette mix TC 15ul/tube pc PC 1 2 3 4 5 1 ul template T TC PC 1 2 3 4 5 54 55 56 57 58 60 62 o C RNU Program Denature 95 ° C 5 min Denaturation 变性： 双链 DNA 模板在