第四章分子克隆中所用酶08012知识讲解.pptVIP

第三章 工具酶 　 基因工程使用的工具酶具有一个重要特征：每一种酶都具有自身特定的功能。有的像手术刀，可以进行DNA分子的特定切割；有的像粘合剂，可以促进DNA分子之间的粘合和连接；有的像砌砖机，可以合成完整的双链DNA分子。 ; 核糖核酸酶(Rnase)专门水解断裂RNA分子, 脱氧核糖核酸酶(DNase)特异水解断裂DNA分子 。 按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类型： 核酸外切酶(exonuclease) :从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。 核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段。 ;常用的工具酶：; ; 限制作用的本质是限制酶的切割反应，修饰作用的本质则是甲基化酶的甲基化作用。 Hsd R:编码限制酶；hsd M:编码甲基化酶；hsd S：表达产物协助上述两种酶识别特殊的作用位点。 当有DNA入侵细菌时，修饰酶修饰宿主自身的DNA，使之打上标记，避免自身的DNA被限制性内切酶分解；限制酶降解外来的DNA，自身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。 限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系统 ; 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的核酸内切酶。 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 据统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。目前已经发现3500种以上，而且商业化的有250种之多．;2. 限制酶的命名 ;几种限制性内切酶命名原则举例 ; I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处随机切割DNA分子中的双链。 III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。 　II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。 ; 绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称内切酶的靶子序列。 识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromic structure）。即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全相同。 ;E coR I的识别顺序为： ? 5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’ 垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。 ; recognition sequence enzymes 5＇ GTT AAC 3＇ Hpa Ⅰ blunt end 3＇ CAA↓TTG 5＇ 5＇ G↓AATTC 3＇ EcoRⅠ 5’protruding end 3＇ CTTAA↑G 5＇ 5＇ A↓AGCTT 3＇ HindⅢ 5’protruding end 3＇ TTCGA↑A 5＇ 5＇ G↓GATCC 3＇ BamHⅠ 5’protruding end 3＇ CCTAG↑G 5＇ 5＇ C↓TGCAG 3＇ PstⅠ 3’protruding end 3＇ GACGT↑C 5＇ ;识别序列在DNA分子中出现的频率 :; 由于那些长的识别序列和富GC或富AT的识别序列在DNA分子中出现的概率很低，所以把这些识别序列相应的限制性核酸内切酶称为稀切酶(rare cutting enzymes)。 ; 4.2Ⅱ型限制性内切酶的酶切特点 ;②如果切点在中轴的左上侧和右下侧, 则产生3’突出的粘性末端： 　　5’…CTGCA↓G…3’→ 5’…CTGCAOH　pG…3’ 　　3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…Gp　OHACGTC…5’ ;粘性末端与平头末端;核酸内切限制酶H