2019年醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质.ppt

醋酸纤维薄膜电泳分离血 清蛋白质 山西大学生科院生化教研室 一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理 二、 实验原理 ? 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的 现象。在一定 pH 条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而 带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移 动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分 离 ? 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的 pH 值、溶液的 离子强度和电渗现象 ? 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大 小和形状 ? 采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。 醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾 和吸附现象等优点 ? 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于 有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的 薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为 120 μ m ，有很强的通透性，对分子移动阻力很小 ? 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有 清蛋白、α - 球蛋白、β - 球蛋白、γ - 球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋 白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速 度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 pH8.6 的缓冲体系 中电泳，染色后可显示 5 条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依 次为α1 - 、α2 - 、β - 及γ - 球蛋白 实验原理 三、实验器材 ? 1.DYY- Ⅲ2型常 压电泳仪：北京 市六一仪器厂生 产， 1 套 /2 组。 ? 操作指南：电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组 成，，两者之间有专门的连线连接。电泳槽有两个 互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极， 红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移 动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头 浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调 节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤 维薄膜就搭在滤纸桥上，。稳压电源用于调节电压 和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后，将点 好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通 电，调整好电压，进行电泳。注意电泳槽的电极方 向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。 目前，该电泳仪已改进为数显式的 DYY-6C 型。 ? 2. 醋酸纤维薄膜（ 2 cm × 8cm ）： 2 片 / 人。 ? 3. 培养皿：一排桌子 （即 4 组）公用 5 套，包 括平衡、染色各用一套， 漂洗用 3 套。 ? 4. 点样器：一个 / 组。 ? 5. 滤纸：公用。 ? 6. 玻璃板：一块 / 组。 ? 7. 镊子：一个 / 组。 ? 8. 玻棒：公用。 四、实验试剂 ? 1 ．巴比妥缓冲液（ pH8.6 ，离子强度 0.07 ）：巴比 妥 2.76g ，巴比妥钠 15.45g ，用蒸馏水定容至 1000mL 。 ? 2 ．染色液：氨基黑 10B 0.25g ，用甲醇 50mL 、冰醋 酸 10mL 、水 40mL 溶解（可重复使用）。 ? 3 ．漂洗液：甲醇或乙醇 45mL ，冰醋酸 5mL ，水 50mL ， 混匀。 ? 4 ．透明液（仅在定量分析时使用）：无水乙醇 7 份， 冰醋酸 3 份，混匀。 五、实验操作 浸泡：将 2 × 8 cm 醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽 面距短边一端 1.5 cm 处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液 的平皿中，浸泡 30 min 方可用于点样 点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液， 然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清， 点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将 点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线 电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在 两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架， 各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳 缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以 驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥 ? 电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝 下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡 10 min 。 通电，调节电压至 160 V ，电流强度为 0.4 ～ 0.6 mA/cm 膜