2019年间接免疫荧光法测ANA.ppt

间接免疫荧光法 检测抗核抗体 （ ANA ） 制作人： XXX 20XX-XX-XX 抗核抗体 ? 【自身抗体】：指抗自身组织、器官、细 胞及其成分的抗体 ? 【 ANA 】：指抗细胞核成分（ DNA ， RNA ，蛋 白质和酶）的抗体。 ANA 存在一个谱 ? ANA 新概念：抗核酸（ Nucleic acid ）和核 蛋白（ Nucleoprotein ）抗体的总称 ? 某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内 更丰富 ANA 检测的意义 ? 有助于疾病的诊断 如抗 Sm 是 SLE 标记抗体； 抗 ScL -70 是 SD 的标记抗体； 抗 Jo-1 是 PM/DM 的标记抗体； ? 观察疾病活动度和治疗反应 ? 研究发病机理 【 ANA 分类 】 ? 抗 DNA （ dsDNA,ssDNA) ? 抗组蛋白（ Histone) ? 抗非组蛋白（ Nonhistone,Extractable Nuclear Antigen, ENA ） ? 抗核仁（ Nucleolus ） 几种 ENA 的由来及同义词 ? Sm ：病人名： Smith ? RNP: u 1 RNP 或 nRNP Nuclear Ribonucleoprotein ? SSA: RO Sjogrens syndrome A ? SSB: La, Ha, Sjogrens syndrome B ? Jo-1: 病人 John ? ScL-70: Scleroderma 【 ANA 由 来】 中性粒细胞 DNP(DNA-Histone) + 抗 DNP + 补体 均质体 LE 细胞 LE 细胞：并非 SLE 特有， PM 、 SD 、 RA 、 SS 等结缔组织病，药物 过敏，慢活肝等亦可阳性。抗 DNP 取代 LE 细胞的检测 + ANA 的筛选：间接免疫荧光法 + + 抗原 抗体（血清） 抗原 — 抗体 第二抗体 ANA 的 筛 选 ： 间 接 免 疫 荧 光 法 实验原理： ? 生物薄膜载片 上的 IgA 、 IgG 、 IgM 类 特 异性抗体 可以与 抗核抗原 反应；随后 ，结合抗体可与 标记荧光的二抗 进行 反应，并可在荧光显微镜下观察。 抗原 人特异性抗体 FITC 标记的抗人抗体 FITC FITC 载片 实验原理： 生物薄片马赛克 TM 技术 【实验步骤】 实验步骤一：准备 ? 检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？ 如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使 用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消 毒时，可于 3 ％的 Sekusept Extra （汉高公 司）中浸泡 1 小时。 ? 只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。 不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对 玻片进行标记。 实验步骤二：样品准备 ? 1:100 稀释血清标本。每次实验均 需加入阳性和阴性对照。对照血清 使用前必须混匀。 实验步骤三：加样 ? 在加样板的每个反应区加入稀释血清， 避 免产生气泡 。滴加完所有待测标本后才 开 始温育 。使用聚苯乙烯加样板。 ? 加样体积 : 25 μ l/ 反应区 (5 x 5 mm) 1 2 3 4 5 样品 1 样品 2 样品 3 阳性对照 阴性对照 实验步骤四：孵育 ? 将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即 开始。 确保每个标本均能够与生物薄片相 接触 ，而 标本之间不相互接触 。室温（ 18- 25 ℃）温育 30 分钟 。 实验步骤五：冲洗 ? 用烧杯盛 PBS-Tween 缓冲液， 流水 冲洗载 片，然后 立即 放入装有 PBS-Tween 缓冲液 的小杯中浸洗 至少 5 分钟 。 实验步骤六：加样 ? 将 20μl 荧光标记的抗人球蛋白 （荧光二 抗）加入 洁净加样板 的每个反应区。 完 全加完所有的二抗后 ， 方可继续温育 （最多可加 50 个载片）。 建议使用连续 加样器 。加样前应使用加样器 混匀 。 为 节约时间，可在第一步温育的同时滴加 酶结合物至另一个加样板的反应区中。 实验步骤七：孵育 ? 从 PBS-Tween 清洗缓冲液中 取出一张载片 ， 5 秒钟 内用吸水纸擦一下背面和边缘后， 立 即 将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在 加样板的凹槽里。 ? 注意：为防止破坏基质， 不要擦拭反应区 的间隙。 ? 检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后 继续下一张。 ?