血红蛋白的提取分离dna的粗提取与鉴定.pptVIP

DNA的粗提取与鉴定 提取生物大分子的基本思路是，选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。提取DNA就是利用DNA与RNA、蛋白质、脂质等理化性质的差异去除杂蛋白。 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，因此可以选择适当盐浓度使DNA充分溶解，使杂质沉淀，或者相反以达到分离的目的。 3. 蛋白酶能水解蛋白质,但对DNA无影响；多数蛋白质不能忍受60~80 ℃ 的高温，而DNA在80 ℃以上才会变性。洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 4. DNA粗提取与鉴定，四个主要的实验步骤： 步骤 目的 ①实验材料的选取——鸡血细胞 DNA丰富 ②破碎细胞 获取含DNA的滤液 ③去除滤液中的杂质 纯化DNA ④DNA的析出与鉴定 鉴定DNA 5. 选取实验材料，原则上凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，为提高实验的成功率要选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血细胞、洋葱等。破碎动物细胞常用蒸馏水，用玻璃棒搅拌后收集滤液。破碎植物细胞需先用洗涤剂、食盐，再进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集滤液。 6. 破碎细胞后获取的滤液可能含有核蛋白、RNA、多糖等杂质。可根据DNA的不同性质除去这些杂质： 7.进一步提纯DNA并使其析出可用体积分数95%、冷却的酒精，然后用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，滤纸吸去上面的水分，鉴定DNA用二苯胺试剂。对照组的操作是：2mol/L的NaCl溶液5ml,加入4ml二苯胺，沸水浴5min，冷却后试管颜色：无色。 8. 注意：鸡血中加3g柠檬酸钠防止血液凝固；加洗涤剂后要轻缓柔和，否则容易产生大量泡沫；玻璃棒搅拌要轻缓以免加剧DNA分子断裂，不能形成絮状沉淀；二苯胺要现配先用，否则会影响鉴定效果；提取器具最好用塑料烧杯，因为DNA容易被玻璃器皿吸附。 血红蛋白的提取和分离 从细胞中提取蛋白质，首先要使细胞破碎，常用的方法有酶解法、超声波法、研磨法。分离不同种类蛋白质的依据是蛋白质各种特性的差异，如分子的形态和大小，所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。 凝胶色谱法又叫分配色谱法。是根据相对分子量大小分离蛋白质的有效方法。构成凝胶球体的成分大多数是多糖类化合物，球体内部有许多贯穿的通道，小分子蛋白质因易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后从层析液中洗脱出来，大分子蛋白质无法进入凝胶内部，只在凝胶珠间隙移动，路程较短，所以首先洗脱出来。 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 利用透析袋透析 装配好的凝胶柱 收集得到的纯化后的蛋白 蛋白质的提取和分离一般分为4步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。后三步的方法依次是：透析、凝胶色谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 * 进一步分离DNA和蛋白质，可利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精的原理。 高温变性分离法 酶解分离法 NaCl溶液分离法 操作 原理 方法 DNA与蛋白质等杂质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同 2mol/LNaCl溶液溶解DNA 0.14mol/LNaCl溶液析出DNA 蛋白质酶分解蛋白质不影响DNA 滤液中加嫩肉粉（木瓜蛋白酶 ）10~15min 蛋白质在60~80℃大多变性 DNA80 ℃以上变性 60~75 ℃保温10~15min 血液 血浆 水 分 其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 2. 血液有哪些成分？ 1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 二、实验操作 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 1.样品处理： （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 ②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋