试验技术路线.ppt

技术路线 双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索： 明场下对脊髓定位，利用双光子强 激光对脊髓进行深度扫描切割损伤 5 小时后通过行为 学软件分析损伤 后的运动能力， 判断损伤程度 对损伤后的斑马鱼 进行解剖，观察扫 描处的脊髓及周围 组织的损伤情况 14dpf 幼年斑马鱼 0.033%MS222 麻醉 同时在损伤位点以下 2mm 注射反向示踪剂 生物胞素 12 小时后做纵切切片， 利用生物胞素抗体做 免疫染色 判断损伤的位置与大 小是否与符合 判断胶质斑痕的位 置与大小是否符合 12 小时后做纵切切 片，利用 GAFP 抗 体和纤连蛋白抗体 做免疫染色 前期实验： 手术建模： 手术组（ n=68 ） 假手术组（ n=68 ） 建模成功性分析：每周分析术 后运动能力，连续跟踪 7 周 基因芯片分析： 提总 RNA 分析全部基因 的表达水平， 统计分析各个 基因表达变化 定量 PCR ： 提总 RNA 反转录 检测 sema4e 和 plxnd1 相 对内参 GADPH 表达 水平的变化 原位杂交： 制作切片 制作探针 检测 sema4e 和 plxnd1 mRNA 的 表达水平变化及 表达细胞 Westen Bolt ： 提总蛋白 检测 sema4e 和 plxnd1 蛋 白表达水平 的变化 取脊髓（损伤位点以下 1cm ）： 术后 4hour, 12hour, 6day, 11day 组 sema4e 与 plxnd1 关系研究： sema4e 活性片段 DNA 的扩增 sema4e 特异性肽段的 设计与合成 sema4e 表达载体的构建 表达载体的导入 转染细胞的筛选与培养 表达蛋白的提取 表达蛋白的活性检测 sema4e 免疫磁珠的制作 sema4e 与 plxnd1 免疫共沉淀 噬菌体展示技术淘选抗体 ELISA 检测抗体活性 ELISA 检测抗体专一性 sema4e 与 plxnd1 免疫共定位 sema4e 与 plxnd1 在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究： 细胞水平 转染的仓鼠肾细胞与神经元共培 养 , 观察轴突生长情况，并通过相 应抗议抑制 sema4e 与 plxnd1 可 能的相互作用后观察轴突生长情 况 转染的仓鼠肾细胞与血管内皮 细胞共培养，观察血管内皮细 胞增殖情况，并通过相应抗议 抑制 sema4e 与 plxnd1 可能的相 互作用后观察血管内皮细胞的 增殖情况 组织水平 损伤 6 周后做神经轴突反向追踪， 观察轴突生长通过损伤面情况 损伤 6 周后，做组织切片，血管 免疫染色，统计损伤处的血管 密度 活体水平 损伤 6 周后，于第一次损伤位点 以下 5mm 显微注射示踪剂 Alexa Fluor Red Dextran,12 小时后活 体观察神经元轴突的生长通过损 伤面情况 损伤 6 周后，活体观察在血管内 皮细胞内表达 GFP 的转基因斑 马鱼的脊髓损伤处血管密度 整体水平 手术后给 sema4e; plxnd1; control morpholino. 6 周后做运动能力分 析，统计比较修复速度 前期结果 Before lesion Red: sham operation (n=10) Blue: operation (n=10) 图 1 ：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化 Real time PCR time points change folds 10X 10X 10X 10X 10X anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day 10X 10X 10X anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day sema4e: plxnd1: 10X 10X 通过双光子显微镜活体观察斑马鱼 脊髓内的血管