代谢工程改造酿酒酵母合成VD3关键中间体胆甾-5,7,24-三烯醇.pdf

代谢工程改造酿酒酵母合成VD3 关键中间体胆甾-5,7,24-三烯醇 代谢工程改造酿酒酵母合成VD3 关键中间体胆甾-5,7,24-三 烯醇 摘 要 维生素 D3 （VD3 ）是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，具有广泛的生理 活性，参与多种生理活动，是一种重要的小分子化合物。传统化学法合成维生素 D3 步骤多，反应得率低，且合成过程环境污染较为严重。随着代谢工程及合成 生物学技术的快速发展，酿酒酵母细胞因其具有较高的同源效率及成熟的分子操 作工具，已成为萜类化合物从头合成的经典宿主细胞。本研究利用代谢工程技术 改造酵母麦角甾醇合成途径，生产维生素D3 前体胆甾-5,7,24-三烯醇。在经典的 酿酒酵母麦角固醇合成代谢中，通过敲除角鲨烯形成步骤有关的ERG5 和ERG6 基因，将终产物麦角固醇转变为胆固醇合成前体，并进一步通过筛选及过表达关 键限速酶，提高目的产物胆甾-5,7,24-三烯醇的累积量。实验结果表明，ERG6 基 因的单敲除细胞酵母甾醇和胆甾-5,7,24-三烯醇的含量得到显著累积；ERG5 基因 的单敲除细胞麦角甾-5,7-二烯醇（Δerg5 ）显著累积，在ERG6/ERG6 双敲除细胞 中目的产物胆甾-5,7,24-三烯醇累积量显著提升，相较于野生的BY4741 下表，上 述细胞用GC-MS 分析几乎无法检测到麦角固醇。而且ERG6 基因的缺失显著地 诱导了生长抑制和遗传转化能力的降低。 为了进一步提高单位细胞产率，研究了麦角固醇合成代谢的关键限速酶编码 基因tHMG1，ERG1 和ERG11 在Δerg5 菌株的单独过表达对代谢产物累积量的 影响。与野生型菌株相比，在Δerg5 菌株中过表达tHMG1 时，固醇含量没有明 显增加，但对菌株的生长有明显的抑制作用。Hmg1p 的过表达导致角鲨烯的大 量积累，Erg1p/Erg11p 的过表达提高了总甾醇和麦角甾-5,7-二烯醇的产量，且对 菌株生长没有明显影响。此外，进一步探究了全局调控因子 upc2-1 对 BY4741 细胞麦角固醇合成代谢的影响，在野生型菌株中过表达 upc2-1 时，麦角固醇产 量明显增加，提高了 1.25 倍。而在Δerg5-upc2-1 中麦角甾-5,7-二烯醇水平和总 固醇产量均降低，分别比对照菌株下降24.0%和16.8%，进一步考察了细胞的氧 化还原水平，发现NADH/NAD+ 比率在Δerg5 细胞中显著上升，为0.708 ，是对 照组的1.64 倍，以上结果表明细胞的氧化还原稳态显著影响终产物的生物合成。 本研究所得数据可作为食品级酿酒酵母中参与角鲨烯后生物合成途径的甾 醇相关中间体生产的参考。 I 浙江工业大学硕士学位论文 关键词：麦角固醇合成代谢；胆甾-5,7,24-三烯醇；关键限制步骤；酿酒酵母； upc2-1 II 代谢工程改造酿酒酵母合成VD3 关键中间体胆甾-5,7,24-三烯醇 METABOLIC ENGINEERING OF ERGOSTEROL SYNTHESIS PATHWAY FOR VITAMIN D3 PRECURSOR CHOLESTA-5,7,24-TRIENOL PRODUCTION IN SACCHAROMCES CEREVISIAE ABSTRACT Cholesterol and its relatives serve a myriad of biological function and it is supposed to be the most highly decorated small molecule in biology with increasing amount of studies on its biosynthetic technology. Herein, the ergosterol