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HPLC色谱峰展宽与色谱柱柱效间的关系 分析物被注入HPLC系统之后，在色谱柱内随着流动相进行迁移并最终从色谱柱中洗脱出来，经检测器检测到的整个过程中，都存在引起色谱峰扩展的因素，包括进样器，色谱柱，检测器，连接管路以及接头等。色谱峰扩展过大导致色谱峰的宽度增加，一定浓度下的样品的峰高降低，导致分析方法的灵敏度降低，众多引起色谱峰扩展的因素可进行简单划分为色谱柱内色谱峰扩展与色谱柱外引起的色谱峰扩展，可以下图1中公式表示： Fig.1 Contribution of band broading in HPLC system 色谱柱外因素引起的色谱峰扩展主要是由于各个仪器部位的死体积以及管路引起的，如各个Peek接头处的死体积，检测器流通池处体积的大小以及色谱柱后管路。色谱柱内引起的色谱峰扩展，也包括色谱柱的死体积以及各种扩散效应，传质阻力以及高压所引起的热效应。 2仪器死体积较大引起的色谱峰扩展 影响分析物在色谱柱内色谱峰扩展的因素比较多，包括色谱柱填料的颗粒大小，颗粒的均匀度，柱床填充的均匀度，色谱柱的长度，色谱柱的内径以及色谱柱的死体积等。 色谱柱填料颗粒越小，粒径分布越均匀集中，柱床填充也就越容易填充均一，色谱柱内死体积也就越小，相对地色谱柱的柱效也会越高。但是，同一根色谱柱用在不同的仪器上，所表现出来的实际柱效可能有所不同，这与所用仪器的状况有紧密的联系，如下图2所示。 Fig.2 Apparent efficient of different columns under different instrument 如上图2所示，200mm × 4.6mm，5um的色谱柱的柱效与100mm × 2.1mm，2.5um的色谱柱在理想的仪器状态下，基本具有相同的柱效(图中红色虚线与蓝色实线)，这也说明填料颗粒上的不足，可以通过增加色谱柱的长度来进行弥补。而同样一根100mm × 4.6mm，2.5um的色谱柱，在50uL2的死体积的仪器上使用时，其柱效要小于200mm × 4.6mm，5um填料的色谱柱，且其柱效随着测试所用的分析物的容量因子的增加而增加，说明色谱柱的理论柱效是不低的，由于仪器死体积较大，对于保留较弱的测试分析物而言，仪器引起的色谱峰扩展较大，造成实际测试柱效较低，这也是小填料细内经色谱柱不适宜用于HPLC仪器上的原因。 3色谱柱内径对色谱峰扩展的影响 同样填料粒径的条件下，色谱柱的内径大小对于色谱峰的扩展是否具有明显的影响呢。窄内径色谱柱在较低的流速下即可获得较高的流动相线速度，能够节省流动相降低成本，特别是对于HPLC-ESI-MS来说，窄内径的色谱柱的低流速，高线速度特点，可以明显提高方法的检测灵敏度，如下图3所示。 Fig.3 The influence of flow rate on relative response of ESI and APCI source 但是，较宽内径的色谱柱对于仪器的死体积要求不像窄内径色谱柱那样要求严格，在不同的仪器上使用都能够具有很好的重现性，窄内径小填料颗粒的色谱柱在HPLC上的使用，除了压力受限之外，最大的因素还是来自于HPLC系统的死体积较大，造成表观柱效较低。 下图4比较了相同填料粒径的条件下，不同的内径对于色谱柱柱效的影响。 Fig.4 The influence of inner diameter on column efficient 在上图4中，比较了不同内径的色谱柱的理论塔板高度，我们发现4.6mm内径的色谱柱的理论塔板高度要比2.1mm的内径的色谱柱低。首先，细内径的色谱柱在相同的填料粒径的条件下，压力要比宽内径的色谱柱要大，在色谱柱的轴向上由于压力引起的热效应要大于宽内径的色谱柱，因此，热效应引起的色谱峰扩展是其中的一个因素，但不是主要因素。 主要因素在于色谱柱内的扩散以及传质阻力效应，其中涡流扩散效应与传质阻力效应之间存在交互作用(如Van Deemter曲线的右半部上升段，纵向扩散为左半部下降段)。 Fig.5 Van Deemter equation of HEPT 上述方程，我们都很熟悉，A为涡流扩散项，B为纵向扩散项，C为传质阻力项。对于纵向扩散，可以通过增加流速以及减小溶质在流动性中的扩散系数的方法(如更换有机相的种类)来减小；传质阻力项，可以通过增加色谱柱的温度，使用小填料颗粒以及降低流速的方式来减小。 涡流扩散项与色谱柱内的填料填充均匀度有关，进而导致流动相流速的不一致。如填料颗粒之间的间隙通道内的流动相流动的不均一性(通道中间流速较大，靠近颗粒表面区域的流速较低)；不同颗粒间隙内的流速不均一性(与色谱柱内部不同区域内填料密度有关)以及色谱柱径向填料填充的不均一性(越靠近色谱柱的内管壁，色谱填料填充的越均一，密实)，造成