党参多糖合成相关基因筛选及Cp1-SST真核表达载体构建.pdfVIP

目录 中文摘要 I 英文摘要 III 前言 1 第一章 党参多糖生物合成相关基因的筛选6 1.1 材料、试剂与仪器6 1.2 试验方法7 1.3 结果 11 1.4 讨论27 1.5 小结29 第二章 基因沉默体系的建立及候选基因沉默载体构建30 2.1 材料、试剂与仪器30 2.2 实验方法31 2.3 结果35 2.4 讨论38 2.5 小结40 第三章 党参Cp1-SST 基因真核表达载体的构建41 3.1 材料、试剂与仪器41 3.2 试验方法42 3.3 结果47 3.4 讨论52 3.5 小结52 全文结论与展望53 全文结论53 展望53 参考文献55 综述60 致谢69 个人简介71 山西医科大学硕士学位论文 党参多糖合成相关基因筛选及Cp1-SST 真核表达载体构建 摘要 党参，我国传统中药，药食同源，中西部为其主要产区。具有养血生津、补 中益气等功效，属传统补益类中药。党参的有效成分包括多糖及甾醇类等，其中 党参多糖药理作用广泛，具有抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫、抗衰老等功效。 山西省道地药材潞党参中多糖含量相比于其他产区显著高出2-4 倍，具有断面油 润等道地特征，表明党参多糖是党参质量评价的重要指标。但是近年来由于党参 种质单一，引种混乱导致栽培党参质量严重下降，因而基于党参多糖的党参优良 种质资源的选育迫在眉睫。从分子水平解析潞党参多糖代谢途径，挖掘党参多糖 合成的关键基因，通过调节基因的表达实现对党参多糖含量的精准调控，进行潞 党参种质资源的遗传改良，对提高潞党参药材质量促进药材的优质生产具有重要 意义。本研究基于前期所构建的党参转录组数据库，结合 qRT-PCR 技术筛选出 与党参多糖积累密切相关的候选基因 CpnsLTP 与 CpCA 并对二者进行了生物信 息学分析；建立了党参VIGS 沉默体系并对其进行了初步优化，成功构建了候选 基因 CpCA VIGS 沉默表达载体；同时对课题组前期所克隆得到的党参 Cp1-SST 基因进行了真核表达载体的构建，为进一步解析潞党参多糖代谢途径奠定基础。 主要研究结果如下： 1. 本研究基于前期所构建的党参转录组数据库，利用 Unigene 在不同组织 中的FPKM 值，筛选出与潞党参多糖含量变化密切相关的基因，进而利用qRT- PCR 技术进一步验证候选Unigene 在不同组织不同发育时期的表达量差异，结合 课题组前期党参多糖含量变化趋势，筛选得到与党参多糖积累呈正相关的候选基 因CpnsLTP 和负相关的候选基因CpCA。 2. 利用TA 克隆与生物信息学分析软件，对候选基因进行生物信息学分析， 结果显示，CpnsLTP 基因全长707 bp ，含有一个348 bp 的ORF ，具有nsLTP 特 异性位点，属于AAI-LTSS 超家族；CpCA 基因全长1186 bp，包含一个789 bp 的 ORF，编码262 个氨基酸，编码蛋白具有保守的CA 催化位点，属于CA 超家族， 氨基酸序列比对结果显示与其他物种的CA 氨基酸序列具有较高的相似度，通过 I 山西医科大学硕士学位论文 构建系统进化树，结果显示CpCA 同黄顶菊CA 的亲缘关系相对密切，可聚为一 支。 3. 利用党参CpPDS 基因为报告基因，建立并优化党参VIGS 侵染体系，结 果显示当党参幼苗苗龄期为4 周，侵染体积为4 mL ，侵染浓度OD600 为1.4 时， 可在侵染20 天时出现党参叶片光漂白现象，相对于课题组前期需要42 天才出现 漂白现象，试验周期大大缩短至22 天。根据CpCA 序列，克隆得到其非保守区 序列，构建了 pTRV2-CpCA 沉默表达载体，为下一步进行基因功能分析奠定