创伤早期钙蛋白酶在心肌细胞凋亡中的作用及其机制研究.pdf

目 录 中文摘要 I 英文摘要VI 常用缩写词中英文对照表XIII 前 言 1 1 材料与方法 2 1.1 动物实验及分组2 1.2 细胞实验及分组2 1.3 主要仪器及试剂2 1.3.1 主要仪器3 1.3.2 主要试剂3 1.4 实验方法4 1.4.1 创伤模型的制备5 1.4.2 Western blot 蛋白检测5 1.4.3 Real-time PCR 9 1.4.4 Caspase-3 活性检测 11 1.4.5 Caspase-12 活性检测 12 1.4.6 细胞培养 12 1.4.7 calpain-2 活性检测 13 1.4.8 siRNA 转染心肌细胞 14 1.4.9 激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+荧光强度 15 1.4.10 流式细胞术检测细胞内Ca2+水平及细胞凋亡率 15 1.5 统计学处理 15 2 结 果 16 2.1 创伤大鼠通过诱导心肌组织calpain-2 的表达激活凋亡蛋白Caspase-3 及 Caspase-12 16 2.1.1 创伤导致大鼠心肌组织凋亡蛋白 Caspase-3 及 Caspase-12 活性增 强，且Caspase-12 活化峰值出现的时间点早于Caspase-3 16 2.1.2 创伤未显著影响心肌组织calpain-1 而显著诱导calpain-2 表达水平 上调 17 2.1.3 钙蛋白酶抑制剂MDL28170 对calpain-1 无明显抑制作用，显著抑 制calpain-2 的表达水平 18 2.1.4 创伤大鼠Caspase-3 及Caspase-12 的活化可被钙蛋白酶抑制剂干预 19 2.2 创伤血清通过Ca2+/calpain-2/Caspase-12 途径诱导心肌细胞凋亡20 2.2.1 创伤血清诱导心肌细胞calpain-2 表达水平增强20 2.2.2 小干扰RNA 抑制创伤后心肌细胞calpain-2 的表达水平21 2.2.3 calpain-2 的siRNA 明显抑制创伤诱导的心肌细胞calpain-2 高表达 22 2.2.4 抑制心肌细胞calpain-2 表达显著降低凋亡蛋白Caspase-12 活化23 2.2.5 干预calpain-2 基因表达显著降低创伤引起的心肌细胞凋亡24 2.2.6 创伤血清导致心肌细胞内Ca2+水平增加25 3 讨 论 27 4 结 论 31 参考文献 32 综述 35 参考文献 41 致 谢 46 个人简介 47 山西医科大学硕士学位论文 创伤早期钙蛋白酶在心肌细胞凋亡中的作用及其机制研究 摘 要 研究背景： 创伤致继发性心脏损伤 （Trauma-induced secondary cardiac injury，TISCI ）是指创 伤患者无心脑血管等慢性病史，在入院 24 h 内常规辅助检查未检测到心功能障碍， 但在创伤后数天或数月出现心脏疾患。由于其病情隐匿，极易漏诊，可能因错过最佳 治疗时间导致患者死亡，因此对其发病机制的研究显得尤为重要。 文献表明，导致创伤后继发性心脏损伤最主要的原因是心肌细胞凋亡，心肌细胞 凋亡是由一系列半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases ）级联反应所致，主要机制包括 死亡受体通路、线粒体通