拟南芥叶绿体蛋白CGF1和CGF2的功能分析.pdfVIP

符 号 说 明 BSA: Bovine serum albumin, 牛血清蛋白 DMSO: Dimethylsulfoxide, 二甲基亚砜 EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid, 乙二胺四乙酸 GUS: β-glucuronidase, β-葡萄糖苷酶 LB: Luria-bertani medium, LB 培养基 MS: Murashige and Skoog, MS 培养基 PBS: Phosphate buffer saline, 磷酸缓冲盐溶液 qRT-PCR: Quantitative real-time Reverse transcription PCR, 实时定量反转录PCR SEM: Scanning electron microscope, 扫描电子显微镜 TBS: Tris buffered saline, Tris 缓冲液 TEM: Transmission electron microscope, 透射电子显微镜 目录 中文摘要 1 Abstract 3 1 前言 5 1.1 叶绿体的分化与结构 5 1.1.1 叶绿体的分化 5 1.1.2 叶绿体的结构 7 1.2 叶绿体在植物生长发育方面的功能 7 1.2.1 叶绿体在调控植物叶片发育中的作用 8 1.2.2 叶绿体在调控胚胎发育中的作用 8 1.2.3 质体在小孢子形成和发育中的作用 10 1.2.4 质体与植物的向重力性 11 1.3 细胞核与叶绿体之间的信号交流 12 1.3.1 核-叶绿体的顺行信号 12 1.3.2 叶绿体-核的逆行信号 13 1.4 核基因编码的叶绿体蛋白 14 1.4.1 核基因编码的叶绿体/质体蛋白的运输 14 1.4.2 核基因编码的叶绿体蛋白在调节叶绿体发育及活性方面的功能 15 1.5 本研究的目的和意义 16 2 材料与方法 17 2.1 材料 17 2.1.1 植物材料及生长条件 17 2.1.2 菌株和质粒 17 2.1.3 酶和各种生化试剂 17 2.1.4 PCR 引物 18 2.2 方法 18 2.2.1 转基因植物表达载体的构建 18 植物总RNA 的提取 18 反转录（试剂盒法） 19 植物基因组DNA 的提取 20 目的基因扩增 20 PCR 产物回收（试剂盒法） 21 TOPO 连接反应 21 TA 连接反应 21 大肠杆菌转化及质粒提取 22 DNA 序列测定 23 0 LR 反应 23 1 T4 连接反应 24 2 质粒DNA 的酶切鉴定 24 3 CRISPR/Cas9 载体的构建 24 2.2.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 25 农杆菌的转化 25 拟南芥的栽培及转化 25 2.2.3 qRT-PCR 26 引物设计及合成 26 反应条件及结果分析 27 2.2.4 药剂处理和各种染色分析 27 叶片的透明化 27 胚的透明化 27 拟南芥胚珠光学切片观察 28 台盼蓝染色 28 亚历山大染色（Alexander staining ） 28 DAPI 染色 29 GUS 染色 29 2.2.5 扫描电子显微镜观察（SEM） 30 2.2.6 透射电子显微镜观察（TEM ） 30 2.2.7 生理学实验及各种量化说明 31 叶绿素含量测定 31 淀粉含量测定（试剂盒法） 31 3 结果与分析 33 3.1 CGF1 和CGF2 的进化树分析及蛋白序列分析 33 3.2 CGF1 和CGF2 为组成型表达 34 3.3 CGF1 和CGF2 的亚细胞定位分析 36 3.3.1 CGF1 和CGF2 定位于叶绿体 36 3.3.2 CGF1 和CGF2 的叶绿体定位依赖于其N 端的信号序列 38 3.3.3 CGF1 和CGF2 定位于非绿色组织中的质体 38 3.4 CGF1 和CGF2 参与调控植物的生长发育 40 3.4.1 CGFs 的突变影响植物营养生长 40 3.4.2 CGFs 的突变影响胚珠及胚的发育 42 3.4.3 CGFs 的突变导致叶片发育异常 45 3.5 CGF1 和CGF2 调控叶绿体的发育 47 3.5.1 CGFs 的突变造成叶绿体完整性破坏 47 3.5