拟南芥ASNAP在有性生殖中的功能分析.pdfVIP

符号说明 BiFC: Bimolecular fluorescence complementation, 双分子荧光互补 BSA: Bovine serum albumin, 牛血清蛋白 Cas9: CRISPR-associated 9, CRISPR相关蛋白9 CRISPR: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 成簇的规律间隔短回文 重复序列 GFP: green fluorescent protein, 绿色荧光蛋白 GUS: β-glucuronidase, β-D-葡萄糖苷酸酶 Kan: kanamycin, 卡那霉素 LB: luria-bertani medium, LB培养基 MS: murashige and skoog media, MS培养基 NSF: N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein, N- 乙基顺丁烯二酰亚胺敏感融合蛋白 qRT-PCR: Quantitative real-time reverse transcription PCR, 定量实时反转录PCR RNAi: RNA inference, RNA干扰 SEM: scanning electron microscope, 扫描电子显微镜 SNAP: soluble NSF attachment protein, 可溶性的NSF 附着蛋白 SNARE: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor, 可溶性的 NSF 附着蛋白受体 UBQ10: promoter of Ubiquitin10, 泛素启动子10 目录 中文摘要 1 Abstract 3 1 前言 5 1.1植物有性生殖 5 1.1.1配子体的发育 5 雄配子体的发育 5 雌配子体的发育 6 1.1.2双受精过程 8 1.1.3配子体发育的调控机制 9 雄配子体发育的调控机制 9 雌配子体发育的调控机制 11 1.2囊泡运输 12 1.2.1囊泡运输的过程 12 1.2.2 SNARE介导囊泡与靶膜的融合过程 14 1.3 α-SNAP与NSF介导SNARE四聚体的解聚 15 1.4 α-SNAP的功能 16 1.4.1 α-SNAP和NSF 16 1.4.2 α-SNAP其它功能 16 1.5 CRISPR/Cas9技术在植物基因研究中的应用及优势 18 1.6本研究的目的与意义 19 2 材料与方法 21 2.1材料 21 2.1.1植物材料及生长条件 21 2.1.2菌株和质粒 21 2.1.3 PCR 引物 21 2.1.4酶和生化药剂 23 2.2方法 23 2.2.1突变体的创制 23 2.2.2突变体的鉴定 24 CRISPR/Cas9突变体鉴定引物的设计 24 植物基因组DNA提取 24 突变体基因组水平的鉴定 25 植物总RNA 的提取 26 反转录 26 2.2.3表达载体的构建 27 高保真Phusion PCR扩增 27 PCR产物回收 28 TOPO连接反应 28 大肠杆菌感受态的制备与转化 29 DNA序列测定 30 质粒的提取（试剂盒法） 30 LR反应 31 质粒DNA 的酶切鉴定 31 农杆菌的转化 31 2.2.4拟南芥的栽培和转化 32 2.2.5拟南芥转基因植株的筛选和鉴定 33 2.2.6 qRT-PCR 33 2.2.7 GUS染色分析 34 2.2.8拟南芥花粉染色 34 2.2.9扫描电子显微镜观察 34 2.2.10树脂切片观察 35 2.2.11透射电子显微镜观察 35 2.2.12拟南芥胚珠透明化及光学切片观察 35 2.2.13药剂处理及荧光染料染色 36 FM 4-64染色 36 Lyso-Tracker Red染色 36 2.2.14激光共聚焦扫描显微镜观察及图像处理 36 2.2.15本生烟的培养和双分子荧光互补实验（BiFC ） 37 本生烟的培养方法 37 双分子荧光互补实验（BiFC ） 37 3 结果与分析 38 3.1 ASNAP 的组织表达模式分析 38 3.2 ASNAP 在拟南