蛋白质表达和抗体制备剖析.pptVIP

蛋白质表达 常用蛋白表达系统 (host) 原核：大肠杆菌。 真核：酵母、昆虫、哺乳动物、植物。 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解； ②商品化的载体和菌株种类非常齐全； ③表达效率高； ④易培养，成本低。 缺点： ①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体； ②蛋白质不能糖基化； ③其内毒素很难除去。 酵母表达系统 优越性： ①蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白； ②表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母 染色体中，实现高效率表达； ③表达载体都为 E.coli/Pichia Pastoris 的穿梭载体，可在获得克隆后采用 E.coli 细胞大量 扩增。 ④易培养，成本低 , 可高密度发酵。 缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。 昆虫细胞表达系统 利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。 优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源 DNA 插入，因此是表达大片段 DNA 的理想载体； ③可进行分泌表达。 缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②表达量有限； ③作为药物宿主细胞未被 FDA 认可； ④培养成本高。 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。 优越性： ①糖基化与人源蛋白一致； ②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高； ③可进行分泌表达。 缺点： ①表达量低； ②培养成本很高，操作繁琐。 植物表达系统 优越性： ①能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质。 ②易于大规模培养和生产。 ③在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势。 缺点： 不易提取与纯化 Factors in E.coli protein expression ? Vector ? Strain ? Growth conditions ? 原核表达载体众多，常用的有 pET(T7 promoter) 、 pQE(T5 promoter) 、 pGEX(GST 融合表达 ) 等。 ? 各载体适应的菌株也不尽相同 pET(BL21(DE3)) 、 pQE(M15,JM109) 、 pGEX(BL21) 。 ? 对于我们来说，最常用和最需掌握的是 pET 表达系统 表达载体 (Vector) Expression plasmid features Lac operon Induction of expression 原核表达宿主菌 名称 特征 用途 抗性 DH5 α 带有 recA endA 突变的克隆菌株，由于 DH5 α 具有 deoR 变异， 可以作为较大质粒的宿主菌使用。 常用的质粒抽提工程菌株 , 可用于蓝白斑 筛选鉴别重组菌株。 无 BL21 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型 用于 PGEX 载体构建质粒的蛋白表达 无 BL21 (DE3) lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，含有 lacI 抑制基因和位于 lacUV5 启 动子下的 T7 RNA 聚合酶基因 用于含有 T7 的 pET 系列载体构建质粒的 蛋白表达 无 BL21(DE3)-RP 在 BL21(DE3) 细胞的基础上，具有额外拷贝的 argU 和 proL 基 因 解决了表达富含 AT 的基因组蛋白密码子 偏倚性问题 氯霉素 BL21(DE3)- RIL 在 BL21(DE3) 细胞的基础上，具有额外拷贝的 argU 、 ileY 和 leuW tRNA 基因 解决了表达富含 AT 的基因组蛋白密码子 偏倚性问题 氯霉素 BL21(DE3)- plysS 带有可以与 pET 共存的、编码 T7 溶菌酶（ T7 RNA 聚合酶的天 然抑制物）的质粒。 pLysS 菌株在被诱导前 T7 RNA 聚合酶 的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和 活力的重组体在宿主中更稳定。带有 pLacI 质粒的宿主菌产生 额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的