抗氧化实验方法.pdf

1 还原力的测定 样品 2ml 加到 2ml 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH6.6 ）和 2ml 1% 的铁氰化钾溶液的混合液 中。混合物在 50℃保温 20min ，然后在反应混合物中加入 2ml 10% 的 TCA ，混合后以 3000rpm 离心 10min ，取上清液 2ml 与 2ml 蒸馏水以及 0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应， 10min 后测定其在 700nm 处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以 5mg/ml 左右变化，例如 2.5 ，5 之类变化。但具体情况应根据吸 光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6 的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光 (400nm) 用玻璃比色皿（即没有标字母或者标 G 的比色皿），紫 外光时（ 400nm ）用石英比色皿（即标 Q 字比色皿） 。 2 DPPH 自由基清除活性的测定 将 1.5ml 样品液添加到 1.5ml 含 0.1 mmol/L DPPH 的 95 ％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置 30min ，然后在波长 517nm 处检测（ Ai ）。清除率计算公式为： 空白为 1.5 ml 95% 的乙醇加入 1.5 ml 蒸馏水调零。 式中： Ac ——对照为 1.5 ml DPPH 溶液加上 1.5 ml 蒸馏水在 517nm 处的吸光值； Aj —— 1.5ml 样品液加上 1.5 ml 95% 的乙醇在 517nm 处的吸光值； Ai —— 1.5ml 样品液加上 1.5 ml DPPH 溶液在 517nm 处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以 2mg/ml 左右变化，如 0.5,1,2,2.5 之类变化，但是具体情况应 视清除率而定，最终结果应有清除率大于 50%和小于 50% 的情况。 DPPH 样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且 DPPH 试剂很昂贵，用时注意节约。 0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取 0.00395gDPPH ，用 95% 的乙醇溶液溶解并定 容到 100ml 。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的 LPO 模型反应体系包括 :体积比为 1:25 稀释的卵黄悬液 (卵黄用 等体积的 pH7.45 ，0.lmol/LPBS 配成，使用前磁力搅拌 10min)0.2 mL 、一定浓度的样品溶液 0.lmL 、25m moll/LFeSO4 溶液 0.2mL ，用 PBS 缓冲液补足至 2.0mL 。对照管除不加样液外 其他试剂同前。将上述 2 种试管同时置 37℃恒温水浴锅中保温培养 1h。取出后，加入 20%TCA0.5mL ，静置 10 min 后，与对照管于 3500r/min 离心 10min ，取 2.0mL 上清液，分 别加入质量分数为 0.8%硫代巴比妥酸 (TBA) 溶液 1.0mL ，加塞于 100℃水浴 15min ，取出冷 却。空白管以 2.0mLPBS 溶液代替，在 532nm 下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白 LPO 的抑 制率表示为 : SA(%)=(Ac 一 AS)/A C×100 式中 :Ac 一不加样品的吸光度 As 一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以 5mg/ml 左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度 进行调整。 硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保存。 并以 50m mol/L NaOH 溶液配制。 再在 50℃ 水浴溶解。 FeSO4 溶液应以棕色瓶盛装。 4 过氧化值的测定 参照本食品