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实验三 糖化摩活力的测定 指导老师:孙运军 研究生:赵渊徐妙  月的和内容 目的:学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容:1.学习糖化酶活力的原理 2.测定并计算糖化酶活力  糖化酶筒介以及其活性的测定原理 ①糖化酶的应用及生产 ②糖化酶的催化原理 ■③酶活测定方法  ■①糖化酶的应用与生产 ■糖化酶,全名葡萄糖淀粉酶( Glucoamylase EC321.3),又名淀粉葡萄糖苷( Amyloglucosidase 或γ淀粉酶(γ amylase),是一种含有甘露糖、葡萄糖 半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,分子量在60~1000kDa之间 因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂,习惯上简称糖化酶  ■糖化酶在工业生产中的应用: 糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主 要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时, 淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序,因为 大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发 酵 糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制 取,还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生 糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂  目前,工业中广泛使用黑曲霉( Aspergillus niger)、 泡盛曲霉 Aspergillus awamori)、米根霉( Rhizopus yxe)和臭曲霉 Aspergillus foetidus)为生产菌株来 发酵生产糖化酶 今天的实验用酶就是利用黑曲霉变异菌株进行液体 深层通风发酵后提取获得 液体深层发酵法 工艺流程 试管斜面种子→种子扩大培养→发酵 过滤→浓缩→干燥→粗酶制剂  ■②糖化酶的作用机制 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的 胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳 链上的非还原性末端(整个碳链只有一个还原端,与之 相对的都是非还原端)依次水解a-1,4糖苷键,切下一个 个葡萄糖单元,并像β-淀粉酶一样,使水解下来的葡萄 糖发生构型变化,形成β-D葡萄糖。对于支链淀粉 当遇到分支点时,它也可以水解a-1,6糖苷键,由此将 支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3 连接的碳链,但水解a-1,4糖苷键的速度最快 都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖 非还尾 还原尾 r-1,6 短支  ③酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘 酸钠法、兰-爱农法(SP法)、 Schoor l 法(DU法)和对硝基苯酚葡萄糖法(NP G法)、35-二硝基水杨酸①NS)等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。 糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下 p范围是4~6,温度范围是40~60℃)进 行反应,生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α-1,4糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。  次碘酸钠法: 碘与NaOH作用能生成 1.T2与NaOH作用 NaI0,而葡萄糖能定 2 Naoh-naio +nal +ho 量地(1:1)被NaI0氧化 2.CH1206与Na0定量作用 在酸性条件下,未与 61206 +Nalo-C6H120r Nal CH12O6作用的Na0可 3.CH2O反应完后,剩余的NaIo 转变成L2析出,因此只 在碱性条件下发生歧化反应: 要用Na2S2O3标准溶液 滴定析出的工2,便可 3 Nalo=Nalo. +2 Nal 计算出未参与反应的 4歧化产物在酸性条件下进一步 NaIO,由此推导出糖 作用生成1 化酶催化所产生的 NaIo3 +5Nal +OH,=312 CH1206的含量。 +nAsO+3h.o 5析出的I2可用标准Na2S2O3溶液 L,+2NaS, O3 sO +nAl  注释 在这一系列的反应中,1mo1葡萄糖与1mo1 aI0作用,而1mo1L2产生1mo1NaI0,因此, lmo葡萄糖与1mo2相当。只要得出对照 组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积, 两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那 部分次碘酸钠的量,从而可以确定酶解 生成的葡萄糖的量,从而计算出酶活。