磁珠提取DNA原理.pdfVIP

； 磁珠纯化 DNA原理 1. DNA 与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定（ SPRI）的分离纯化方 法。磁珠体系中一般包含：磁珠、 DNA、聚乙二醇（ PEG）、以及盐离子等，在 一定浓度的 PEG和盐离子环境中， DNA 可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面 （即 固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的 DNA 分子可以被洗脱回 收。 纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同，但基本上固态的球状 材料组成并无太大差异， 基础结构一般分为 3 层，最内层的核心是聚苯乙烯、 第 3 4 二层包裹磁性物质 ——四氧化三铁（ Fe O ），最外层表面是羧基（ -COOH）修 饰的高分子材料所构成，其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中， PEG是影响 DNA 回收的决定性因素（其他因素还包括 DNA 大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等）。 DNA 在一定浓度的 PEG存在条件 2 下， NaCl 或 MgCl 促进条件下，使 DNA 发生脱水反应，分子构象会发生急剧变 化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随 PEG分子量、浓度以 及盐浓度的不同，不同长度的 DNA 可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中， 特定分子量的 PEG 的功能主要是与盐离子共同作用， 改变不同长度 DNA 的分子 构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降，增 加磁珠在空间位置的碰撞与排斥， 从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果， 除此 之外， PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。 当处于 PEG和盐离子环境中的 DNA，因脱水作用而发生分子构象改变后， 会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团， 与表面带负电荷的羧基磁珠结 ’. ； 合，但如何解释负负电荷之间的作用，目前还不得而知。但普遍认为，这是由于 + 带正电荷的盐离子的作用（如 Na ）。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如 Na+ ）与羧基形成离子桥，使 DNA 被特异性吸附到羧基磁珠表面。当 PEG和盐 类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化 DNA，解除其三者之间的离子 相互作用，使得吸附到磁珠的 DNA 被纯化出来。 磁珠的出现，使得核酸制备的实验可以实现自动化，同时相较于传统的回收 方式，还具有 3 个明显的优势： 1）效率更高，以 DNA 为例， 1 μL磁珠的承载量 可达 7 μg；2 ）避免使用有机溶剂， 如酚类、 氯仿等等， 更加安全； 3 ）操作简单， 无需离心，也更有利于保留核酸的完整性。 2. 蛋白酶 K 的作用 蛋白酶 K 具有降解蛋白的功能， 而细胞膜主要是由蛋白质构成的富有弹性的 半透性膜，因此蛋白酶 K 能够裂解细胞，从而