folin酚试剂法测定蛋白质含量.pptVIP

Lowry s 法（ Folin- 酚试剂法） 测定蛋白质含量 Determination of protein content by Lowry s method 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验目的 ? 掌握 Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其 实验操作技术。 ? 掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品 溶液中待测定物质含量的方法 。 生物化学与分子生物学实验教学中心 选择测定方法时应考虑 ? 实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ? 蛋白质的性质； ? 溶液中存在的干扰物质； ? 测定所花费的时间等。 生物化学与分子生物学实验教学中心 本法概述 ? 1921 年， Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸 - 磷 钼酸）起蓝色反应。 ? 1951 年， Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加 碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。 生物化学与分子生物学实验教学中心 什么是双缩脲反应？ ? 两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（ H 2 N-OC-NH-CO-NH 2 ） ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与 Cu 2+ 发 生双缩脲反应 ，生成 紫红色络合物。 生物化学与分子生物学实验教学中心 原理 1 第一步：双缩脲反应 ? 蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（ -CO-NH- ），同样能 在碱性条件下与 Cu 2+ 发生双缩脲反应，生成的 紫红色络合物 （蛋白质 - Cu 2+ 复合物）。 且在 540nm 处的吸光度与蛋白质的 含量在 10 ～ 120g/L 范围内有良好的线性关系。 生物化学与分子生物学实验教学中心 原理 2 第二步 Folin- 酚显色反应 ? Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸 盐 - 磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈 蓝色反应 ( 钼蓝和钨蓝的混合物 ) 。由于蛋白质中含有带酚羟 基的酪氨酸 ( Tyr ) ，故有此显色反应。 即 蛋白质 - Cu 2+ 复合物 中所含的酪氨酸残基 还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成 蓝色的化 合物 。 生物化学与分子生物学实验教学中心 原理 3 在一定浓度范围内， 蓝色 的深浅度与蛋白质 浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液 比色即可求出蛋白质的含量。 即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中 蛋白质的含量。 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验材料 ? 样品 健康人血清 （正常人血清蛋白质含量： 60 ～ 80 g/L ） ? 试剂 1. 牛血清白蛋白标准液（ 200μg/ml ） 2. 碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3. Folin - 酚试剂 ? 仪器与器材 1. V-1100 分光光度计 2. 恒温水浴箱 3. 试管 6 支、试管架 4. 加样枪、加样枪架 生物化学与分子生物学实验教学中心 操作步骤 ? 取 6 支试管，做好标记，按下表顺序操作： 加入物（ ml ） 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液 - 0.20 0.40 0.60 0.80 - 样品液（ 300 倍稀释） - - - - - 0.50 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.50 碱性硫酸铜溶液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 各管蛋白浓度（ ug/ml ） 0 40 80 120 160 未知 ? 各管混匀，室温放置 10min 。 ? 向各管内加入 Folin- 酚试剂 0.20ml , 2s 内迅速混匀 ！ 40℃ 放置 10min 。 ? 冷却至室温后，以 500nm 波长比色，用 1 号管 作空