复旦大学遗传学.pptVIP

筛选 DNA 文库 用标记的核酸作为探针 用诱饵质粒筛选表达 cDNA 文库 探针标记 标记物： 同位素标记： 32P 非放射性标记：荧光标记，生物素， dig( 地高辛） 等 变性 模板 DNA 随机 6 核苷酸引物， dNTP, 某种标记 dNTP DNA Pol I 5‘ 随机引物 标记的 DNA 片段 Synthesize Radioactive PROBE Purified templete Klenow, random primer probe 第十一章 遗传工程 利用转基因手段对生物进行 人为改造的技术 什么是遗传工程？ 体外 DNA 重组技术：利用工具 酶将外源片段和载体连接，导 入生物体并使其稳定复制和传 代的技术 目的 ? 研究工作 ? 生物产品 ( 生物反应器 ) ? 改良物种 ( 提高品质 ) ? 基因治疗 工具酶 A. 剪切酶类 有目的有选择的把目的片段切开 B. 连接酶类 将目的片段和载体相连 C. 其他工具酶 修饰 , 加工等作用 限制性内切酶 II 及其产生的 3 种不同末端 5 突出的粘性末端 3 突出的粘性末端 平末端 EcoR I EcoR V Pst I P P P P P P 同切酶和同粘酶 同切酶 : 识别相同的位点 , 但生成不同的末端 . 同粘酶 : 识别不同的位点 , 但产生相同的粘性末端 Sma I 5 ′ ... C C C^G G G ... 3 ′ 3 ′ ... G G G^C C C ... 5 ′ Xma I 5 ′ ... C ^ C CG G G ... 3 ′ 3 ′ ... G G GC C ^ C ... 5 ′ 同切酶 BamH I 5 ′ ... G^G A T C C ... 3 ′ 3 ′ ... C C T A G^G ... 5 ′ Bgl II 5 ′ ... A^G A T C T ... 3 ′ 3 ′ ... T C T A G^A ... 5 ′ 同粘酶 Sau3A 5 ′ ... ^G A T C ... 3 ′ 3 ′ ... C T A G^ ... 5 ′ 连接酶及其对底物的要求 : T4 Ligase, Ecoli Ligase 底物 : 自由 5 末端和自由 3 末端 , 5 末端带磷 酸基团 反应条件： Mg++ ， ATP 存在 聚合酶 (polymerase): DNA 聚合酶 I, klenow 片段 , Taq, Pfu, 末端转移酶 外切核酸酶 (exonuclease): exo III, S1 核酸酶 , DNase I 脱磷酸酶 (dephosphatase): 碱性磷酸酯酶 CIP 磷酸化酶 , 激酶 (kinase) 逆转录酶 (reverse transcriptase) RNase H, RNase A 甲基化酶 (methylase) 其它工具酶 载体及其构成基本要素 ? 能独立复制并稳定传代 : 复制起始点 ori 或自主复制序列 ARS 和着丝粒 , 端粒 ? 方便插入外源片段 : 单酶切位点 ? 选择标记 : 药物抗性 ? 报告基因 : 插入筛选标记 ? 易分离提取 ? 高产率（多拷贝） ? 强启动子 ? 多宿主 常用载体 质粒 (plasmid) ，粘粒 (cosmid) ，噬菌体， 噬粒 (phagemid), 病毒， PAC ， YAC ， BAC 特殊用途的载体 表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体 宿主 ? 繁殖快 , 易于培养 , 能够快速得到产物 ? 对所携带基因的表达产物具有较高耐受性 , 具有 克隆最多种基因的可能 ? 突变率低 , 能够稳定忠实的保存被克隆基因 常用宿主 大肠杆菌 : 繁殖快 , 易培养 , 易分离产物 噬菌体 : 转化效率高 , 易于保存 酵母 : 繁殖最快的真核生物 , 适于有蛋白质加工 的基因表达 lacZ