基因载体的选择与构建.pptVIP

加 IPTG 和 X-GAL 乳糖和诱导物 IPTG 的化学结构 i so p ropyl-beta-D- t hio g alactopyranoside X-gal X-gal 水解 筛选结果 ? 蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表 达出由完好的 α LacZ 序列编码的 功能 性的 α 片段 ? 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉 素菌，质粒上 α LacZ 序列 上有 插入片 段 筛选结果模式图 蓝 菌 落 蓝白菌落 筛选白色菌落 二、噬菌体载体与黏粒载体 一）噬菌体载体 λ 噬菌体是大 肠杆菌的噬菌体， 它由外壳蛋白和 λ -DNA 组成 噬菌体 ( 电镜图） 1 、 λ -DNA 的物理图谱 λ -DNA 为 线状双链 DNA 分子 ，两端各有一个 12 核苷 酸的互补单链（粘性末端） GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA ，称为 cos 区 ，全长 48.5kb 。 特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。 cos 位 点 的 作 用 2 、感染周期 噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细 胞，将其 DNA 导入 ： （ 1 ） 吸附 （ 2 ） DNA 注入 （ 3 ） DNA 复制 （ 4 ） 包装 : 只能包装 λ -DNA 分子的 75%-105% 即包装范围为 36.4kb-50.9kb 的 DNA （ 5 ） 裂解 第三章 基因载体的选择与构建 一、载体的功能、特征及质粒载体 克隆载体（ clony vector ） ：具有在细胞内进行 自我复制的 DNA 分子，起运送目的基因到受体 细胞的作用。 目前基因工程中常用的载体有： 细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、 病毒载体、人工染色体等。 一）载体的功能 1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件 二）载体应具备的特征条件 1. 能在宿主细胞内 独立和稳定的自我复制 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或 整合位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有 多种单一的酶切位点 5. 具有合适的 选择性标记 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 三）质 粒 （ plasmid ） 质粒 是存在于细菌细胞质中独立于染色体 而自主复制的 共价、封闭、环状双链 DNA 分子 （ Covalently closed Circular DNA, ccc DNA ）。 ★ 不是细菌生长所必需的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在 1-200kb 之间 1 、质粒的基本特性 （ 1 ）自主复制性 携带有自己的复制起始区（ ori ） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体 DNA 而自主复制 （ 2 ）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中 不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存 （ 3 ）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类 松弛型复制 严谨型复制 （ 4 ）可转移性 在天然条件下，大多质粒可通过 细菌接合作用从一种宿主细胞内转移 到另外一种宿主内。 2 、质粒的构建 （ 1 ） 天然存在的两种质粒 A 、 colE1 宿主细菌大肠杆菌 6.5kb 松弛型 复制 20-30/cell B 、 pSC101 宿主细菌沙门氏菌 8.8kb 严谨型 复 制 5copy/cell （ 2 ） 质粒人工构建的目的 天然质粒存在缺陷 不适合用作基因工程的载体 必须对之进行改造构建 方法 : 重组 ，“ 拼拼接接，挖肉补疮 ” （ a ） 加入合适的选择标记基因 （ b ） 增加或减少合适的酶切位点 （ c ） 缩短长度 ， 增加装载量 （ d