基因组测序技术.pptVIP

新一代测序技术 —— 454 基因组测序技术 背景介绍 DNA 测序技术经历了漫长而曲折的发展历程，它已广泛应 用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通 量 DNA 测序技术予以解决。 迄今为止，我们获得的绝大部分 DNA 序列都是基于 Sanger 测序法获得的。但在过去几年，大规模平行测序平台 （ massively parallel DNA sequencing platform ）已经发展为 主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令 DNA 测序费用降 到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测 序中心的 “ 特权 ” 能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技 术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据 库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。 新一代 DNA 测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全 面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的 各项数据。 测序策略 454 基因组测序使用了一种新的测序策略 —— 循 环芯片测序法（ cyclic-array sequencing ），也可将 其称为 “ 新一代测序技术或者第二代测序技术 ” 。 所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满 DNA 样品的芯片重复进行基于 DNA 的聚合酶反应（模板 变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反 应。 与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作 更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广 泛的应用。 测序策略 图 a 为高通量鸟枪 Sanger 测序法策略 图 b 为鸟枪循环芯片测序法 策略 测序原理 在体外构建好的两端带接头的单链 DNA 文库在 一个油包水的乳液环境中进行 PCR 扩增，因为起始 阶段模板浓度非常低，因此，大部分包还有磁珠的 为乳液滴都只含有一种模板，经 PCR 扩增后，每个 磁珠只连有一种模板的扩增产物，然后打破为乳液 滴，收集磁珠，加入芯片中。 测序原理 经乳液 PCR 法扩增后携带有大量模板的磁珠被 放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序， 每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦 磷酸，然后焦磷酸和腺苷酰硫酸在磷酸化酶的催化 下生成 ATP ，然后荧光素酶就可以在 ATP 参与下将 荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器 检测到。 工作流程 文库制备 乳液 PCR 焦磷酸测序 加入含酶小微珠 芯片制备 工作流程 一 . 样品输入并片段化 大的样品例如基因组 DNA 或者 BAC 等被 打断成 300 － 800 bp 的片段；对于小分子的非 编码 RNA 或者 PCR 扩增产物，这一步则不需 要。 工作流程 二 . 文库制备 借助一系列标准的分子生物学技术，将 A 和 B 接头（ 3 和 5 端具有特异性）连接到 DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测 序步骤。具有 A 、 B 接头的单链 DNA 片段组成 了样品文库。 工作流程 三 . 一个 DNA 片段连接一个磁珠 单链 DNA 文库被固定在特别设计的 DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单 链 DNA 片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳 化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包 含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 工作流程 四 . 乳液 PCR 扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行 独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性 序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。 对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个 相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增 的片段仍然结合在磁珠上。 工作流程 五 . 测序 携带 DNA 的捕获磁珠（ 20um ）随后放入 PTP 板（ Pico TiterPlate ） 的微孔（ 29um ）中 进行后继的测序反应。此反应释放出的光信号 实时被仪器配置的高灵敏度 CCD 捕获到。有 一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一 分子的光信号。由此一一对应，就可以准确、 快速地确定待测模板的碱基序列。 工作流程 六 . 数据分析 454 测序系统可以在 10 小时的运行当中获 得 100 多万个读长，读取超过 4-6 亿个碱基信 息。并提供两种不同的生物信息学工具对测序 数据进行分析，适用于不同的应用：达 400 MB 的从头拼接和任何大小基因组的重测序。 454 测序系统图示 A 为液体试剂供应装置 B 为反应池 C 为光线检测成像系统和计算机 控制系统