基因扩增技术PCR.pptVIP

7 、对很难扩增的片段可考虑用下游引物反转录。 8 、对长片段的策略。 RT-PCR 实验的策略 PCR 污染的对策 1 、隔离不同的实验操作区，将提取 RNA 操作区、引物 分装区、 PCR 操作区及 PCR 产物分析区分开； 2 、分装试剂，把试剂分装成小份，在冰箱中保存。目的 是为了减少重复取样所造成的污染； 3 、改进实验操作，实验时戴一次性手套，加样中要避免 反应液的飞溅。在操作多份样品时，要制备标准混合 液，将各组分混匀后再分到不同的管，这样可以减少 操作污染，并且提高微量加样的精确度。 PCR 污染的对策 4 、设置对照 阳性对照：用已知的阳性模板； 阴性对照：加无关的或不加模板 DNA; 重复实验：为防止因各种原因引起的实 验 误差，应进行反复验证， 以确 保实验结果的重演性。 污染的处理 ? 酸处理：用 1M 的稀盐酸擦拭或浸泡污染器 件，可促进 DNA 脱嘌呤； ? 紫外灯照射： UV 波长一般选择 254/300 nm ， 照射 30 分钟即可。紫外照射可促使 DNA 形成 二聚体，阻止链的延伸。紫外照射对长片段 的 DNA 有效，对短片段效果不大。 巢式 PCR(nested PCR) 对于极微量的靶序列，一次扩增很难取得满意的效果，则可 用巢式 PCR 进行多次扩增。引物之间的关系如下图所示： 引物 1 和引物 4 进行第一次扩增，其产物作为模板，用引物 2 和 3 作为再次 PCR 的引物。如果一次 PCR 产物在凝胶上有可见 的条带，二次 PCR 只能用第一次 PCR 产物的 1/10 4 -10 5 为模板。 实时定量荧光 PCR 实时 PCR （ real time PCR ） 是 1996 年以来发展起来的一种 新技术。 1 、荧光定量 PCR 技术的整个操作过程在完全封闭的状态下进 行，有效的避免了“假阳性”的实验结果。 2 、荧光探针的使用提高了检测灵敏度和特异性，并能够准确 定量样品的 模板数 。 3 、 PCR 扩增后不需进行电泳等后处理，而直接定量样品模板 数，使其具有分析时间短，重复性好、省力、低费用等优 点。 Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 （ PCR ） Polymerase chain reaction 又称无细胞分 子克隆系统或特异性 DNA 序列体外引物 定向酶促扩增法，在 模板 DNA ， 引物 （模板两端的已知序列）和 四种脱氧核 苷酸 存在的情况下， DNA 聚合酶依赖的 酶促合成反应 。 PCR 的定义 PCR 技术是由 Cetus 公司和加利福利亚大 学 1985 年联合创造的，主要贡献者为 Kary B mulis 和 HeneryA 、 Erlich 。可将极微量 的靶 DNA 特异地 扩增上百万倍，能检测 每 10 万个细胞 中仅含 一个 靶 DNA 分子 的 样品。因而发明人 Kary B 、 mulis 获 1993 年诺贝尔化学奖。 1993 年获诺贝尔化学奖 PCR 的种类 ? RT-PCR ? 反向 PCR ? 不对称 PCR ? 多重 PCR ? 巢式 RT-PCR ? 实时定量荧光 PCR PCR 温度循环参数 ? 变性 (denature) 温度和时间 模板 DNA 的变性：模板 DNA 双链在 93-96 加热 2 -10 解离；经 PCR 扩增形成的双链 DNA 在 93-96 ° C 加热 30” - 1 。 ? 退火 (anneal) 温度和时间 : Tm-5 ° C 温 度 降 至 5 5 C 左 右 ， 特 异 引 物 与 模 板 D N A 单 链 配 对 结 合 。 ? 延伸 (extend) 温度和时间： 72 ° C 1000 碱基 / 分钟 在 TagDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模 板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链。 ? 循环数 在 25~30 个循环内，扩增的 DNA 量增加明显，然后进入平台期。 靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高。 PCR 扩增效率（理论） 以上三步为一个循环。每一循环的产物可