优质教材、K210 食品微生物检验技术、K209 农产品微生物检验技术 优质教材、W4504副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点、W4504副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点 W4504副溶血性弧菌检验-检验操作程序及要点-4-微教材.docxVIP

PAGE \* Arabic 6 / NUMPAGES \* Arabic 6 《农产品/食品微生物检验》课程-微教材 微课名称 副溶血性弧菌检验-检验操作程序及要点 关键词 副溶血性弧菌；检验；操作；要点 微课类型 讲授型 微课形式 PPT动画式 画中画式 教学设计模式 讲授法 教学目标 掌握副溶血性弧菌检验操作程序 明确副溶血性弧菌检验操作要点 教学内容 知识点 技能点 副溶血性弧菌检验操作程序 副溶血性弧菌检验操作要点 副溶血性弧菌检验操作 副溶血性弧菌检验操作要点把控 知识讲解 1、样品制备 在无菌室内，以75%酒精擦拭外包装，尤其是包装开口处，用无菌剪刀在样品封口处剪开外包装，换一个无菌剪刀，将三文鱼样品剪碎至无菌罐中，用无菌镊子夹取并称取25 g样品至盛有3%氯化钠碱性蛋白胨水225 mL中，转入注明样品信息、检测人员以及检测日期的均质袋中，密封，用拍击式均质器拍击2 min。若样品为液态，不需均质，振荡混匀即可；鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃；如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分；3%氯化钠碱性蛋白胨水为选择性增菌液，其高浓度盐含量可抑制除嗜盐微生物外的其他微生物生长。 均质完毕的样品通过传递窗出无菌室，清理无菌室，打开无菌室紫外灯，辐照灭菌30 min。非冷冻样品采集后应立即置7 ℃～10 ℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻。 将上述均质完成的检测样品置于预先设置36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养8 h～18 h。 2、分离 病原微生物分离鉴定工作应在BSL-2实验室生物安全柜中进行。 用接种环在距离增菌液液面以下1 cm 内沾取一环增菌液，分别划线接种TCBS琼脂平板或弧菌显色培养基平板上。本片将分别演示这两种平板的分离现象。 接种完成后，置于36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养 18 h～24 h，待观察。副溶血型弧菌在TCBS琼脂平板上培养一般不超过24 h，随培养时间的延长，一些非目标菌（如霍乱）代谢产生的酸会不断挥发，同时代谢蛋白胨产生一定的碱性物质，两者综合导致菌落由黄色逐渐向蓝绿色转变，从而引起误判现象。所以应尽快（不超过1h）挑取菌落或作标记； 副溶血性弧菌在各分离平板上的菌落特征如下: TCBS琼脂平板上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～3 mm； 弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定，使用法国科玛嘉弧菌显色培养基，现象为紫红色。 3、纯培养 用接种环挑取TCBS琼脂平板或弧菌显色培养平板上3个或以上可疑菌落划线接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板。挑取可疑菌落时可以选择其中一种平板上的菌落，也可以两种都挑取。 置于36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养 18 h～24 h，待后续鉴定实验。 4、初步鉴定 副溶血性弧菌的初步鉴定包括氧化酶试验、革兰氏染色试验、三糖铁（TSI）试验、动力试验以及嗜盐性试验。 氧化酶试验：用接种环（或一次性接种环）挑取纯培养单菌落于氧化酶安瓿瓶中，在1 min内观察现象，不变色者为阴性，呈现紫色为阳性。 革兰氏染色试验：取洁净载玻片，于其上滴加一滴生理盐水，用接种环将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 三糖铁（TSI）试验：用接种环挑取纯培养的单菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面，先在斜面划线，再于底层穿刺，置于36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养24 h后观察结果。本片三糖铁（TSI）试验结果为：底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。三糖铁培养基含有葡萄糖、蔗糖和乳糖等三种可发酵的碳源，这些碳源被菌体利用产酸，可使酚红指示剂变色。某些菌能还原Na2S2O3产生H2S，与硫酸亚铁铵反应生成黑色的FeS，而使培养基变黑。 动力试验：用接种针挑取纯培养单菌落，穿刺半固体动力培养基，置于36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养24 h后观察结果。本片动力试验结果为：沿动力培养基中穿刺线扩散生长，有动力； 嗜盐性试验：用接种环挑取纯培养的单菌落，分别接种 0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，置于36 ℃的培养箱中培养24 h后观察液体混浊情况。本片嗜盐性试验结果为：待检菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和 8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。 根据以上初步鉴定结果可初步判断为可疑副溶血性弧菌属，需