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2007-4-19 健康科学研究所 B 细胞与自身抗体研究组 刘占杰
CaCl2法制备感受态细胞
1、划线（无选择性 LB-Agar 平板），37℃培养 16-20h；
2、挑单菌落到 2ml LB 培养液中，37℃,300rpm 摇菌过夜；；
3、取 1ml 过夜菌液到 100ml LB 培养液中，37℃,300rpm 摇菌约3hr，检测 OD600nm about 0.4
4、将菌液转移到 50ml BD 管中，冰上放置 10min；
5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置 1min；
6、用 0.1M CaCl -MgCl （80mmol/l MgCl,20mmol/l CaCl ）溶液 30ml 重悬细胞沉淀,冰上 30min；
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7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置 1min；
8、用 2ml 预冷 0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其 200μl／管分装到灭菌 EP 管中，冻存于-80℃。
附：0.1mol/l CaCl ： 100ml(1.1g 无水 CaCl ＋100mlddH O)高压除菌；
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0.1mol/l CaCl -MgCl : 150ml(2.439g MgCl ·6H O, 0.333g 无水 CaCl ＋150mlddH O) 高压除菌；
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转 化
1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入 1μl（50ng）待转化质粒；
2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min
3、加入 SOC或 LB 培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；
4、取 200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养 14-18h，观察菌落；
质粒小抽(Beyotime)
1、挑单菌落到 3ml 选择性 LB 培养液中，37℃，225rpm，14-18h；
2、收菌液到 1.5ml EP 管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一
次，每管收集 3ml 菌液）
3、用 250ul溶液 I 预冷（保证 P1 已加 RNase），Vortex 重悬细胞；
4、加溶液 II 250ul，颠倒混匀 4-6次，室温 3min；
5、加入 350ul 溶液Ⅲ，随即颠倒离心管 4-6 次混匀，可见白色絮状物产生;
6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)
7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心 60 秒，倒弃收集管内液体；
在质粒纯化柱内加入 750ul 溶液 IV，最高速离心 60 秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；
再最高速离心 1 分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;
8、将质粒纯化柱置于 1.5ml 离心管上，加入 50ul 溶液 V 至管内柱面上(中央)，放置 1min; 最高速离心
1min，所得液体即为高纯度质粒。（通常为 0.1-0.3mg/ml）
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