通过引入突变病毒元件P19m及优化sgRNA骨架提高CRISPR_Cas9系统在番茄基因组中的编辑效率.pdfVIP

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘 要 本研究以番茄为实验材料，探究提高 CRISPR/Cas9 系统编辑效率的方法，并 总结出一套操作简便，高效快捷的操作系统。 CRISPR/Cas9 系统由sgRNA 和Cas9 蛋白两个元件构成，系统构建十分简便， 同时Cas9 对靶位点的剪切十分精准，因此在基因编辑领域备受青睐。然而在实际 的应用中，CRISPR/Cas9 系统的编辑效率并不理想。目前对植物中 CRISPR/Cas9 系统的应用主要限制在编辑效率不高，以及植物遗传转化的组织培养成功率过低。 本研究在组织培养成功率难以大幅提高的情况下，通过优化 CRISPR/Cas9 系统来 提高其编辑效率。主要方法如下： ① 哺乳动物的研究中发现通过优化gRNA 的骨架结构能够显著地提高 Cas9 的编辑效率，本研究将验证该方法在植物中的可能性。本研究将 gRNA 的双链延 长5 bp （UGCUG ），并将连续序列中第四位胸腺嘧啶（T ）突变为胞嘧啶（C ）或 鸟嘌呤（G ）。将一个含有 spacer1 序列的原始gRNA 和一个含有 spacer2 序列的 优化gRNA 构建到一个CRISPR 系统中 （GOG ），同时将一个含有相同spacer1 序 列的优化gRNA 和一个含有相同spacer2 序列的优化gRNA 构建在另一个CRISPR 系统中（OGOG ）。以spacer2 位点的突变数为校准，比较spacer1 位点上原始gRNA 和优化gRNA 的编辑效率。 ② 对PDS 基因编辑的研究结果表明，在CRISPR/Cas9 系统中引入P19m 可以 抑制外源DNA 的转录后沉默，同时又不会像P19 那样引起植株异常死亡，本研究 在此基础上进行了验证。本研究将P19 的第127 位点处的胞嘧啶（C ）突变为胸腺 嘧啶（T ），使P19 蛋白的第43 个氨基酸由精氨酸 （Arg ）突变为色氨酸（Trp ） 从而得到P19m 蛋白。将P19m 序列整合在CRISPR/Cas9 系统的表达载体上，然后 通过与报道的未加入P19 元件的CRISPR/Cas9 系统比较编辑效率，确认P19m 对 编辑效率的提升。 ③ 本研究通过优化的GoldenBraid 构建CRISPR/Cas9 载体系统，并优化了植 物基因组DNA 的提取流程和Peasy-ZERO 载体的构建，实现操作流程的简化和实 验操作速率的提升。并通过自制的大肠杆菌感受态来实现节约实验成本的可能。 本研究通过靶定与miRNA 相关基因的第一个外显子序列，对相关基因进行敲 除，然后在T0 代转基因植株中检测突变率，已经初步验证了通过优化gRNA 骨架 和引入P19m 元件能够使CRISPR/Cas9 系统在番茄基因组中的编辑效率得到提升。 研究获得了六个不同转基因类型，共目前得到的编辑效率为71.4% 。 I 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 通过优化gRNA 结构和引入P19m 两个方面改造番茄中的CRISPR/Cas9 基因 编辑系统，得到了编辑效率的提升，并在此基础上优化表达载体构建和番茄遗传 转化的方法，开发一套简便的标准化操作流程，使快速高效的基因编辑成为可能。 关键词：番茄；CRISPR/Cas9 ；P19m ；gRNA 的骨架 II 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 Abstract In this study, tomatoes are used to be genetically modified by CRISPR/Cas9