组织总RNA提取--用于miRNA分析(TRIZOL).docVIP

组织总RNA提取（TRIZOL） 器具和耗材 加样器一套、匀浆机、离心机 RNase-free的2ml管、RNase-free的各种规格吸头（1ml、200ul、10ul） 镊子、研苯、保温杯 试剂： Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free水 操作步骤： A 准备工作 至少在实验前2小时将清洗干净的研钵加入适量酒精,点燃； 清理实验台面，清除易燃物品； 根据样品编号清晰标记RNase-free的1.5ml管； 每管加1.2mlTrizol试剂，盖好盖子； 将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。 B 组织研磨和匀浆 1. 取冰冻组织材料50－100mg置于放有液氮的研钵中，在研钵中加液氮研磨成粉末（尽量细），注意持续补充液氮；（如果组织块很小，一般不用研钵研磨，直接加入Trizol，用匀浆器匀浆。） 2. 用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至已装有1.2mlTrizol的离心管中，迅速摇开冰冻组织; 3. 立即用组织匀浆机匀浆，如果没有组织匀浆机可用Votex； 4. 匀浆后置于室温静置5分钟（或更长）。 C 氯仿抽提去除蛋白和DNA 加入300ul氯仿（每毫升Trizol加0.2ml氯仿），剧烈震荡混匀，室温静置10分钟或更长。 12000g，4℃离心15分钟 D 沉淀、溶解RNA 将上清液转移到新的2ml离心管中，加入等体积异丙醇（约800ul）（一般，每毫升Trizol加0.5ml异丙醇；但如果加与上清液等体积的异丙醇，会增加RNA尤其是miRNA的得率）；上下颠倒混匀，置-20℃冰箱放置2小时以上（一般，此步是置室温搁置10分钟即可，但如果置-20℃冰箱放置过夜，会增加RNA尤其是miRNA的得率）。 12000g，4℃离心30分钟（一般，离心10分钟即可，但如果离心时间为20-30分钟，会增加RNA尤其是miRNA的得率。另外，我们在提取总RNA用于miRNA分析时，这一步使用25000×g离心15分钟）。 小心去掉上清液，沉淀用2ml 的75%乙醇洗涤（将沉淀飘浮起来即可），不需打碎。 12000g，4℃离心15分钟。（我们在提取总RNA用于miRNA分析时，这一步使用25000×g离心10分钟） 弃掉乙醇，室温干燥沉淀3分钟（注意不要过渡干燥沉淀，否则难以溶解），视沉淀多少将其溶于适量DEPC水中，分装一部分用于质量检测，其余冻存于-70℃冰箱中备用。 F RNA质量检测 1. 取1μl样品，1％琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。如果28S和18SrRNA条带清晰整齐，且28S条带的亮度是18S的两倍，说明RNA完整性较好。 2. 浓度测定：取1μl样品，稀释至50ul，测定OD260和OD280及其比值。若OD260/ OD2801.8，说明RNA纯度较好。 对于RNA样品：OD260的值为1时，RNA的浓度为40μg/ml, 即：1 OD260=40μg/ml RNA, 所以如果稀释倍数为200，则： RNA样品浓度= OD260 × 40μg/ml × 稀释倍数 = OD260 × 40μg/1000μl × 200 =OD260×8（μg/μl） G 提取RNA注意事项 ①Trizol用量为材料的10倍体积，材料过多易造成降解。研磨材料时要保持低温，以防RNA降解。 ②RNA干燥时间过长则不易溶解，注意当沉淀边缘变模糊时即可停止干燥，开始溶解。 ③实验中所用有机废液应倾倒至指定容器中，以免腐蚀下水管道。 ④Trizol有一定毒性，避免接触皮肤和眼睛。 附RNA电泳图谱：