PCR引物设计及PrimerPremier50使用介绍精选.pptVIP

121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctc atgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgc ggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1 的编码序列 (~4000bp) 红色 为信号肽 , 蓝色 为 BamHI 酶切位点 , 下划线 标出酶切位点的阅读框 31 PCR 引物设计及相关软件使用 1 主要内容 ? PCR 介绍 ? 引物设计原理 ? 引物设计的优化原则 ? Primer Premier 5.0 介绍 ? 举例说明引物的设计 2 PCR 介绍 1 、什么是 PCR 2 、 PCR 的组成 3 、如何提高 PCR 成功率 （定量，对照） 3 引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的 核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。引物设计总体上包含三个程 序：序列下载，同源性比较，引物设计 筛选 。 4 5 引物设计的原则 1 、引物长度 大多数应用的最短引物长度为 18 个核苷 酸。如果期待的产物长度等于或小于 500 bp ，选用短的 (16 ～ 18) 的引物；若 产物长 5 kb ，则用 24 个核苷酸的引 物。有人用 20 ～ 23 个核苷酸引物得到 40 kb 的产物。 6 引物设计的原则 2 、引物 GC 含量 GC 含量在 40% － 60% 之间，以 45-55 ％ 为宜。这可为有效退火提供足够热。 7 引物设计的原则 3 、引物 Tm 引物所对应模板序列的 Tm 值最好 72 ℃ 左右。至少要在 55 － 80 ℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G) 8 引物设计的原则 4 、引物 3 端 ? 引物 3 末端和模板的碱基完全配对 ? 防止一对引物内的同源性 ? 考虑末端 5 个碱基的 ΔG ? 引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位 9 引物设计的原则 5 、 引物序列与模板序列组成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组 成与模板序列组成的相似性，相似性高 则错误引发率高 。 10 引物设计的原则 6 、 最好在模板 cDNA 的保守区内设计 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序 列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物 种的同一基因，通过序列分析软件（比 如 DNAman ）比对（ Alignment ），各 基因相同的序列就是该基因的保守区。 11 引物设计的原则 7 、 引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物自身不应存在互补序列，否则引物 自身会折叠成发夹结构（ Hairpin ）使引 物本身复性。这种二级结构会因空间位 阻而影响引物与模板的复性结合。 12 引物设计的原则 8 、 碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是 3 端相似性较高的序列，否则容 易导致错误引发（ False priming ）。 13 引物设计的原则 9 、 引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。 如果与其它基因不具