干细胞常用实验技术protocol.pdfVIP

实验室内部的人胚胎干细胞protocol 人类胚胎干细胞H1和H9维持方案 一、试剂配制 饲养层细胞培养基 Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM) DMEM (GIBCO 11960-044) 450ml FCS GIBCO 16000-044 50ml 10% Pen/Strep 2.5ml 50IU/ml L-glut GIBCO 25030-081 5ml 2uM/ml 人类胚胎干细胞培养基 HESC-Media KO-DMED GIBCO 10829-018 480ml KOSR GIBCO 10828-028 120ml 20% 10mM NEAA GIBCO 11140-050 6ml 0.1mM L-glut(0.2M) GIBCO 25030-081 6ml 2mM Pen/Strep 3ml 55mM BME GIBCO 21985-023 1.1ml 0.1mM ITS GIBCO 41400-045 6ml 4-80C 避光保存。用前每50毫升加200-400ng bFGF 细胞冻存培养基 FBS-DMSO FCS GIBCO 16000-044 9ml 90% DMSO SIGMA D2650 1ml 10% 细胞消化液 Trypsin-EDTA 0.25% Trysin-1mM EDTA GIBCO 25200-056 2ml 0.05%,0.2mM PBS(-) 14190-144 8ml MEF 细胞有丝分裂终止液 Mito C Mitomycin C 0.2mg 0.05mg/ml dd-H2O 15230-162 4ml 避光保存。 Mito C 的终浓度为10ug/ml 即40吸ul 工作液加到 2ml F-DMEM 中。. 0.1% Gelatin(用于培养皿的包被) 1% Gelatin 40ml 0.1% ddH2O GIBCO 15230-162 360ml 高压消毒。 二、 培养方案 一) 饲养层细胞的培养 1、主要实验材料 （1）培养液为F-DMEM。 （2）小鼠 周龄为7～8w 的性成熟母小鼠和周龄为8w 的种公鼠。 2. 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养 （1）小鼠胚胎的准备 1)性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。 2)每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当 天上午定为怀孕的0.5d。 3)取怀孕12.5～14.5d 母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。 4)用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。 5)取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置于有PB 或无血清DMEM 平皿内。用PB 洗涤 三次,弃除表面残余血迹。 6)沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PB 或无血清DMEM 平皿内, 充分洗涤,弃除表面红细胞。 7)用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PB 洗涤三次。 8)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PB 或无血清DMEM 平皿内,用PB 至少洗涤三次,充分弃除红细胞。 （2）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养 二) 培养方法有两种: 组织块培养法和单细胞悬液培养法。 组织块培养法： 1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪