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白菜型冬油菜生长锥分化调控基因的功能分析 摘 要 北方白菜型冬油菜具有优异抗寒性，是我国北方寒区唯一可越冬的冬油菜类型，研 究发现，生长缓慢，根系发达，生长锥凹、苗期匍匐生长等植物学性状与抗寒密切相关。 大量试验结果表明，生长锥表现为凹陷的品种抗寒性远远强于生长锥凸起的品种，由此 推测抗寒性不同的品种的生长锥形态特征的调控机制可能存在差异。本研究挑选与生长 锥调控相关且与实验室转录组数据比较差异显著的6 个基因，定量分析其在不同抗寒性 白菜型冬油菜生长锥中的表达量差异，筛选出两个差异显著的基因进行功能分析，主要 研究结果如下： 1.筛选出STM与CUC2 两个与生长锥形态相关的基因，其中，STM在抗寒性强、生 长锥凹陷的品种中相对表达量低于抗寒性弱、生长锥凸起的品种，而CUC2 基因相对表 达量与STM基因相反，在抗寒性强、生长锥凹陷生长的品种中相对表达量高于抗寒性差、 生长锥凸起生长的品种。 2.克隆获得长度分别为1554bp和 1104bp的STM和CUC2 基因。低温胁迫后，STM和 CUC2 基因上调表达，﹣4 ℃时达最高值。不同品种间STM和CUC2 基因相对表达存在显 著差异，STM基因在生长锥凸起的Lenox 中相对表达量高于生长锥凹陷的陇油7 号等品 种，而CUC2 基因相对表达量与STM基因恰好相反，即生长锥凸起的Lenox 中相对表达 量低于生长锥凹陷的陇油7 号品种。 3.STM和CUC2 基因在生长锥中特异表达并参与低温胁迫应答。STM和CUC2 基因在 Lenox和陇油7 号的茎、根、生长锥中较叶片均上调表达，在生长锥中相对表达量最高， STM基因在生长锥凸起的Lenox 中表达量高于生长锥凹陷的陇油7 号，而CUC2 基因在生 长锥凸起的Lenox 中表达量低于生长锥凹陷的陇油7 号。低温胁迫后，STM和CUC2 基因 的相对表达量在各组织间存在差异，在叶与根中先下调，后上调表达，茎与生长锥中均 上调表达，-4 ℃时达最高值，其中STM基因在Lenox 中较陇油7 号上调更加明显，而CUC2 基因变化趋势恰好相反。启动子功能分析表明STM和CUC2 基因均含有参与光响应、逆 境胁迫、生长素应答、分生组织表达相关的多个顺式作用元件，其中STM还含有参与应 激反应的顺式作用元件。GUS染色表明CUC2 基因主要在植株幼苗的叶片边缘、茎部及 生长锥部位表达。 I 甘肃农业大学2020 届硕士学位论文 4.转基因后功能分析结果表明，STM对生长锥生长的调控作用不显著，而CUC2 基 因抑制生长锥的生长，两者均受低温诱导表达。研究显示，野生型拟南芥在苗期叶片较 STM过表达植株宽大，开花期与成熟期无显著差异，而CUC2 过表达植株与其野生型植 株在苗期无显著差异，开花期CUC2 过表达植株生长发育缓慢，植株矮小，结实较晚， 结实率低。低温处理后，STM过表达拟南芥存活率及SOD、POD 、PRO等生理活性均优 于野生型，﹣4 ℃处理24h后达最高值。CUC2 过表达拟南芥的抗冻实验结果表明，-4 ℃ 处理后，12 h 内CUC2 过表达拟南芥抗寒性相关生理指标及存活率均优于野生型，但12h 后野生型及过表达植株抗寒性及存活率无差异。 以上研究结果表明，STM与CUC2 在白菜型冬油菜生长锥中高度表达并受低温诱导， 其中STM基因通过促进白菜型冬油菜生长锥部位细胞的分裂来促进其生长，而CUC2 作 为植物生长的负调控因子，通过抑制生长锥部位细胞分裂来抑制生长锥生长，两者之间 存在负反馈调节作用。 关键词：白菜型冬油菜；生长锥；基因克隆；表达分析；转基因拟南芥 II 白菜型冬油菜生长锥分化调控基因的功能分析 SUMMARY Northern winter Brassica rapa has excellent cold resistance, and is the o