Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternaria alternata侵染结构分化的调控作用.pdfVIP

Hog1 、Slt2-MAP 激酶对梨果蜡质及疏水性诱导 Alternaria alternata 侵染结构分化的调控用 摘 要 促分裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase, MAPK ）级联信号途径对 病原真菌生长、形态建成、侵染结构分化、次生代谢、致病性及渗透胁迫响应等多种生 理功能具有调节作用，其调控作用因病原物种类、互作系统而异。为进一步阐明 Hog1 与Slt2-MAP 激酶是否参与及如何调控Alternaria alternata 响应梨果表皮疏水性和蜡质信 号从而启动侵染的过程，本试验在药理学试验的基础上，对梨果致病真菌 A. alternata （JT-03 ） MAPK 基因 Hog1 、Slt2 进行鉴定、克隆和生物信息学分析，并构建缺失突 变株和回复菌株，从分子水平上系统研究了 Hog1 和 Slt2 的生物学功能及对 A. alternata 响应梨果皮蜡质物化信号进而启动侵染的调控机制，结果如下： 1. 药理学结果表明 MAPK 特异性的抑制剂 SB203580 可显著地抑制梨果蜡质和 疏水性诱导的 A. alternata 孢子萌发及附着胞的形成，同时也减弱了 A. alternata 对早 酥梨的致病能力。 2. 对 Hog1 、Slt2-MAP 激酶进行基因克隆后分别得到大小为 1615bp 和 1747bp 的 克隆产物 AaHog1 和 AaSlt2 。同源序列比对得知 AaHog1 和 AaSlt2 基因编码产物均分 别含有高渗反应所需的独特磷酸化基序“TGY”和自我磷酸化位点“TEY” 。二级结构的主 要元件是 α-螺旋和无规卷曲，三级结构具有稳定的空间结构，均属于亲水性稳定蛋白。 系统进化树表明AaHog1 与AaSlt2 基因分别与Alternaria longipes 的Hog 和Alternaria arborescens 的Slt 基因的同源性高达99%和91% 。 3. 利用同源重组法构建ΔAaHog1 , ΔAaSlt2 , ΔAaHog1-C 和 ΔAaSlt2-C 突变株。与野 生型相比，ΔAaHog1 和ΔAaSlt2 的孢子形态和大小均发生了变化，菌落生长缓慢，产 孢量分别显著降低了12.53%和68.13 ％（p0.05 ）；ΔAaHog1 和 ΔAaSlt2 在涂蜡表面和 疏水表面孢子萌发、附着胞和侵染菌丝均显著低于野生型，其中 ΔAaSlt2 在洋葱表皮涂 蜡表面的侵染结构分化显著受到抑制，培养8 h 时，附着胞和侵染菌丝形成的相对抑制 率高达 67.76%和 93.33% （p0.05 ）。 4. ΔAaSlt2 对细胞壁干扰剂（CR 和SDS）和 H O 胁迫较为敏感，ΔAaHog1 对 2 2 各种外界胁迫（NaCl ，sorbitol ，CR ，SDS 及H O ）均敏感。ΔAaHog1 和 ΔAaSlt2 的 2 2 细胞壁降解酶活性（PG ，PMG ，Cx 和 β-葡萄糖苷酶）、黑色素和 ALT 毒素的含量均 显著低于野生型；同时发现ΔAaHog1 和ΔAaSlt2 损伤接种的早酥梨3 d 后病斑直径抑制 I 甘肃农业大学2020 届硕士学位论文 率分别为57.07%和 57.48%（p0.05 ），并且梨果黑斑病并未随着贮藏时间的延长而扩展。 综上，AaHog1 与 AaSlt2 均对梨果黑斑病菌 A. alternata 孢子的形态、侵染结构、 生长、细胞壁完整性和致病性等均具有调控作用。其中 AaSlt2 在参与 A. alternata 对 梨果蜡质与疏水性的识别和响应过程中发挥更重要的作用。 关键词: Alternaria alternata ; Hog1-MAPK; Slt2-MAPK; 基因敲除; 功能验证 II H