cAMP-PKA信号途径调控梨果皮蜡质物化信号诱导Alternaria alternata侵染结构分化的分子机制.pdfVIP

甘肃农业大学2020届硕士学位论文 摘 要 果实表皮角质层在病原物与寄主互作中具有双重作用，一方面作为病原物侵染的 物理屏障，另一方表皮的物理化学信号对病原物，尤其对亲和性菌株的侵染具有诱导 作用，但其调控机理尚需进一步揭示。本研究以梨果黑斑病菌A.alternata 为研究对象， 先通过药理学方法研究cAMP 特异性抑制剂阿托品对梨果皮蜡质提取物诱导的A. alternata 生长、侵染结构及致病性的影响；进一步对梨果致病真菌A. alternata 基因 PKAc 和PKAr 进行克隆和生物信息学分析的基础上，构建ΔAaPKAc 和ΔAaPKAr 突变 株，从分子水平上系统研究了PKAc 和PKAr 基因对A.alternata 生长、胁迫响应、梨 果皮蜡质诱导侵染结构的形成和致病性的影响。结果如下： 1. cAMP信号级联通路抑制剂阿托品处理后显著抑制了表皮疏水性和蜡质介导的 A.alternata 的孢子萌发和附着胞形成。其中抑制剂处理后4h，A.alternata 在高疏水性 和果蜡涂膜表面附着胞形成率分别较对照降低了75.3%和63.7%。外源cAMP 的处理 可部分恢复其抑制剂的作用，外源cAMP+阿托品处理后4h，在高疏水性和果蜡涂膜 表面，A.alternata 附着胞形成率为抑制剂阿托品单独处理的2.4 倍和1.6倍。 2. 通过NCBIblast 分析和基因克隆，从A.alternata 基因组中鉴定出cAMP 依赖 性蛋白激酶PKA 的催化亚基和调节亚基，命名为PKAc 和PKAr。梨黑斑病菌A. alternata 的PKAc 和PKAr 基因的ORF 全长分别为1571bp 和1737bp，分别编码488 和461个氨基酸。各功能结构域和其它真菌PKA 激酶催化亚基和调节亚基的同源性较 高，PKAc 和PKAr 均含有其保守RXSY 和RRXS结构域。PKAc 基因在梨果蜡质涂膜 表面诱导A.alternata 附着胞形成过程中的表达量显著高于单独疏水膜，而PKAr 基因 在疏水膜诱导孢子萌发过程中表达量显著上调。 3. 采用同源重组策略和农杆菌转化法对A. alternata 的PKA 激酶催化亚基PKAc 和调节亚基PKAr 进行敲除，获得具有潮霉素抗性的转化子，经过DNA 水平和RNA 水平的双重鉴定，最终得到了ΔAaPKAc 和ΔAaPKAr 突变株。与A. alternata 野生型菌 株相比，ΔAaPKAc 菌落生长缓慢，生物量减少、产孢量增加，而ΔAaPKAr 丧失了分生 孢子形成能力。ΔAaPKAc 和ΔAaPKAr 突变株胞内cAMP 含量升高、PKA 含量降低。 ΔAaPKAc 突变株对氧化胁迫和渗透胁迫的耐受性增加，对细胞壁合成抑制剂的敏感性 cAMP-PKA 信号途径调控梨果皮蜡质物化信号诱导Alternaria alternata侵染结构分化的分子机制 增强，相反，ΔAaPKAr 突变株较野生型对氧化胁迫和渗透胁迫更敏感。此外，ΔAaPKAc 与野生型菌株相比在损伤接种的梨果上扩展能力降低，且与野生型相比ΔAaPKAc 突变 株黑色素增加，毒素TEN、ALT、AME 和AOH 的含量降低，同时也降低了胞外降解 酶Cx 和β-葡聚糖酶活性。 4. 高疏水性和梨果蜡提取物涂膜表面显著促进了A. alternata 的孢子萌发和附着 胞形成，ΔAaPKAc 相比于野生型菌株显著降低了表皮疏水性和蜡质介导孢子萌发和附 着胞形成，其中对附着胞形成的抑制效果更加显著，当培养4h 后，在高疏水性（108°） 和果蜡涂膜表面ΔAaPKAc相比于野生型菌株附着胞形成率分别降低了31.6%和38.3%。 洋葱表皮脱蜡再涂果蜡表面可以显著促进A.alternata 附着胞和侵染菌丝的形成。 综上所述，cAMP-PKA 信号通路在梨黑斑病菌A.alternata 的生长、致病性和生物 胁迫中发挥着重要的作用，且cAMP-PKA 信号通路参与了梨果表皮物化信号介导的A. alternata 侵染结构的调控。 关键词：cAMP-PKA 信号通路；A.alternata；生物信息学；基因敲除；功能验证 甘肃农业大学2020届硕士学位论文 SUMMARY The cuticle of the