精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程-编制说明.docVIP

PAGE 1 精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程 编制说明 一、项目来源、起草单位和起草人 本标准是根据“内蒙古自治区市场监管局关于下达2020年第2批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知（内市监标准字〔2020〕166号）”，由内蒙古自治区农牧业科学院组织有关科技人员，制定《精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程》。由内蒙古自治区农牧业科学院提出并起草；主要起草人为王丽芳、姚一萍、史培、张三粉、宋洁、钟华晨、杨健、郭晨阳、连海飞、羿静、冯小慧。 二、制定本标准的目的意义 奶牛乳房炎不仅给乳制品加工业带来巨大损失，而且还危害公共卫生安全和人类的健康。几十年来世界各地把抗生素列入治疗乳房炎的首选药物，然而由于长期反复使用，使病原体对药物产生了耐药性，降低了疗效，且使奶中抗生素的残留增加，严重危害人类健康（Oliveira等,2015），每年约有70万人死于多重耐药细菌的感染（Kr?mker等,2017）。因此采用精准用药，减少细菌耐药性产生具有重要意义。 三、制定标准的依据 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草，以实用性、科学性和可操作性为基本原则。本标准的主要参数，在对奶牛乳房炎治疗时，建议优先选择耐药率R≤5%的药物，其次是25%≥R5%的药物，主要技术指标来源于农业农村部奶产品质量安全风险评估重大专项“生鲜乳中乳房炎源病原微生物耐药性评估”和内蒙古自治区科技成果转化项目“植物提取物对奶牛乳房炎防控技术示范推广”。 四、编制过程 （一）、标准制定过程 根据农业农村部奶产品质量安全风险评估重大专项“生鲜乳中乳房炎源病原微生物耐药性评估”和内蒙古自治区科技成果转化项目“植物提取物对奶牛乳房炎防控技术示范推广”的要求，主要起草人于2018年上半年查阅了国内外相关文献，确定了实施方案，根据实施方案的具体要求，对乳房炎源生鲜乳中大肠杆菌等病原微生物进行了分离鉴定和药敏试验，建立了耐药菌谱图；进一步于2019年在实施内蒙古自治区科技成果转化项目“植物提取物对奶牛乳房炎防控技术示范推广”中，在奶牛养殖场进行了推广示范。结果表明，奶牛养殖场应用本规程，可以精准选择药物，减少了牛奶中抗生素的残留，降低了耐药性产生，有效防控了奶牛乳房炎的发生。根据试验结果，形成《精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程》初稿，然后由主要起草人牵头成立标准起草组，形成工作组讨论稿；于2020年8月编制形成了征求意见稿。 （二）、试验过程 1 试验材料 1.1 仪器设备 电子天平、高压灭菌锅、生物安全柜、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高速离心机、小离心机、PCR仪、微波炉、DNA电泳设备、凝胶成像系统、麦氏比浊仪、移液器（包括多通道300μl，单通道5 ml/1 ml/200 μl/10 μl/2.5 μl）、-20℃冰箱、-80℃冰箱。 1.2 试剂耗材 乳头药浴液、70%酒精棉球、实验服、一次性乳胶手套、口罩、纸巾、无菌10 ml、50 ml离心管、封口膜、试管架、泡沫箱、冰袋、记号笔、5%绵羊鲜血平板（BHI琼脂加5%绵羊血，需要自行配制）、无菌血清、脑心浸液肉汤、LB肉汤、60%无菌甘油（使用分析纯甘油与双蒸水配制，配制后进行灭菌）、双蒸水、5 ml/1 ml/ 200 μl/10 μl 灭菌枪头、2 ml灭菌离心管、9 cm直径的培养皿、1μl和10 μl两种规格的无菌接种环，锥形瓶、量筒、16 S rDNA引物、PCR试剂盒、及电泳胶制备所需试剂、DNA marker、MHB肉汤、比浊管、质控菌株ATCC 29213/25922。 1.3 药敏板 96孔组合式药敏MICMBC测试盒（冻干型）购买自天津市金章科技发展有限公司，产品信息详见说明书。 2 试验方法 2.1 病料采集 采集患乳房炎病畜乳457批次。 2.2 细菌的分离、纯化、保存 2.2.1分离 将奶样混匀，用无菌接种环蘸取奶样，划线接种到直径为9 cm的5%绵羊血琼脂平板，将平板放在 37 ℃的恒温培养箱中培养，剩余的奶样置于4℃冰箱中保存，备用。24 ~ 48 h后观察菌落生长情况及形态特征，并做好记录。 2.2.2纯化 用1 μl的无菌接种环挑取典型单个菌落， 接种到不同的肉汤中于 37 ℃恒温摇床培养箱中增菌培养。8 ~ 16 h后用1 μl的无菌接种环在血平板上进行划线培养，将平板放在 37 ℃的恒温培养箱中培养 24 ~ 48 h。若无杂菌生长则认为该细菌已是纯化的细菌，若有杂菌生长则需重新纯化。 2.2.3分离菌保存 从血平板上挑取已经纯化的典型单个细菌接种到肉汤中，于 37 ℃恒温振荡培养箱中增菌培养8 ~ 16 h，按照400 μl菌液加入200 μl 60%无菌甘油的比例进行菌种保存，充分混匀，制成终浓度为20%的甘油菌，封口，做好标记-80℃冰箱冷冻保存。 2.3