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PCR 常见问题集锦 1. cDNA 产量的很低 可能的原因： *RNA 模板质量低 * 对 mRNA 浓度估计过高 * 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足 * 同位素磷 32 过期 * 反应体积过大，不应超过 50 μl 2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅 * 最常见的原因在于您的反应体系是 PCR的反应体系而不是 RT-PCR的反应体系 * 与反应起始时 RNA 的总量及纯度有关 * 建议在试验中加入对照 RNA * 第一链的反应产物在进行 PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过 1/10 * 建议用 Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（ GSP）用于第一链合成。由于 RNA 模板 存在二级结构，如环状结果，有可能导致 GSP无法与模板退火；或 SSⅡ反转录酶无法从此 引物进行有效延伸。 * 目的 mRNA 中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决： a. 将第一链的反应温度提高至 50℃。 b. 使用随机六聚体代替 Oligo(dT)进行第一链反应。 3. 产生非特异性条带 * 用 RT 阴性对照检测是否被基因组 DNA 污染。如果 RT 阴性对照的 PCR结果也显示同样条带， 则需要用 DNase I重新处理样品。 * 在 PCR反应中， 非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。 在低于引物 Tm 2 至 5℃的温 度下进行退火，降低镁离子或是目的 DNA 的量将减少非特异性结果的产生。 * 由于 mRNA 剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的 RT-PCR结果。 4. 产生弥散（ smear）条带 * 在 PCR反应体系中第一链产物的含量过高 * 减少引物的用量 * 优化 PCR反应条件 / 减少 PCR的循环次数 * 在用 DNase 处理被 DNA 污染的 RNA 样品时， 其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增， 一般会显示为弥散背景。 5. 产生大分子量的弥散条带 * 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的 * 对于长片段的 PCR，建议将反应体系中 cDNA 的浓度稀释至 1:10 （或1:100-1:200 ） 6. 在无反转录酶的情况下，对照 RNA 获得扩增结果 * 通常是由于对照 RNA 中含有痕量 DNA 而导致的。 由于进行体外转录时不可能将所有的 DNA 模板消除。建议可将第一链 cDNA 稀释 1:10、 1:100 、 1:1000 倍以消除 DNA 污染所造成的影 响。 * 有可能是引物二聚体的条带 7. 扩增产物滞留在加样孔中 * 有可能是由于模板量过高而导致 PCR结果产生了高分子量的 DNA 胶状物。 建议将第一链结 果至少稀释 100 倍再进行二次扩增。 * 另外，在二次 PCR时使用的退火温度如果比引物的 Tm 值低 5 ℃，可以将退火温度适当增 高或进行热启动以提高特异性。 8. SSⅢ与 SSⅡ有何不同？ * 具有更高的热稳定性（达 50℃） * 具有更长的半衰期（达 220 分钟） * 对 PCR无抑制 * 干冰运输 *Tdt 活性更低 9. 为什么有人更喜欢用 SSⅢ而不是 ThermoScript？ ThermoScript 如果保存不当会引起活性很快降低， SSⅢ则更稳定。 10. 为什么使用基因特异性引物（ GSP）？ GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。 OligodT 引物建议用于高质量 RNA 及全长转录本的 逆转录；随机引物用于 mRNA 片段的逆转录。