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第三节酶标记物的制备 荸密  酶制剂及其底物 ◆作为标记抗体用的酶应满足下列要求 (1)活性高 (2)性质稳定 3)专一性强 (4)酶催化底物的显色信号易于判断和测量 5)方法敏感,重复性好,简单易行 (6)酶的底物易于配制保存,酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶, β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。  辣根过氧化物酶( Horseradish Peroxidase,rRP) 心HRP比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备 心HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,由无色的酶蛋白和 棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18% 心HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3~9, 酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,PH5左右。 心HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403m和275n 一般以OD4o3nmn/OD25m的比值RZ表示酶的纯度。 令高纯度的酶RZ值应在30左右(最高可达34)。  HRP酶促反应 今酶促反应的过程 HRP DH2十H2O2D+2H2O ◆供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。目前用 得较广泛和较满意的供氢体是:OPD和TMB。另外 ,还有一种供氢体称ABTS[2,2-边氮基双(3乙基 苯并噻吡咯啉-δ磺酸)],灵敏度和稳定性均好。 ☆由于HRP的底物H2QO2本身又是酶的抑制剂,因此酶 促反应中使用的H2O2不能过量。  HRP常用底物 底物 产物性质 主要吸收峰波长(mm) ABTS 绿色水溶性产物 410、650 OPD 桔黄色水溶性产物 492 邻苯二胺 TMB 蓝色水溶性产物 370、652 四甲基联苯胺 加入硫酸或磷酸,产生黄色 DAB 不溶性棕色沉淀 免疫组化 33—二氨基联苯胺 Chloronaphthol产物颜色介于蓝色-蓝紫色,易于成像免疫印迹、免疫组化 AEC 棕红色沉淀,容易成像 多重染色的第二标记  碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, ALF ALP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的 水解酶,由多个同功酶组成 令小牛肠粘膜ALP分子量为100kDa,酶作用的最适pH为96 大肠杆菌ALP分子量为80kDa,最适pH为8.0 令ALP作用底物较多,常用的酶底物有对硝基苯磷酸盐PNP) β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等 心ALP主要用作双标记染色,研究递质共存及酶免疫测定 ALP标记抗体,一般采用戊二醛作交联剂一步法,使酶和抗 体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。  ALP常用底物 底物 产物性质 主要吸收峰波长(mm) 黄色产物-基酚 nn 对-硝基苯磷酸酯 NBT 不溶性黑紫色沉淀 免疫印迹 ☆其它:酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、阝-D半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶  二、酶结合物的制备方法餐象 ◆作为酶标记对象的抗原与抗体要求 抗原要求纯度高,抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比 活性较高,能批量生产,易纯化  制备方法要求 (1)技术方法简单、产率高,重复性好; (2)标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性; (3)酶标记物稳定,不形成聚合物。  几种常用标记方法比较 方法 原理 酶标记率 直接结过碘酸过碘酸钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基,70% 合法盐氧化与抗体抗原中氨基反应,形成 Schiffs碱 法 戊二醛酶和抗体抗原同时加入戊二醛溶液中 步法戊二醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨 基反应,生成Schi碱 联二醛酶和抗体抗原先后分别加入戊二醛溶液5~25% 二步法中 马来酰双功能交联剂PDM通过酶和抗体/抗原中高 亚胺法巯基将两者偶联起来 异双功异双功能基团交联剂 HECCM分别通过其85% 能基团羟琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗 交联法体抗原上游离氨基和巯基结合