生物化学检验技术（2015）、生物化学检验技术 酶学分析技术基本知识、酶学分析技术基本知识 酶学分析技术基本知识-2.pptxVIP

第五章 酶学分析技术永州职业技术学院 陈武哲酶学分析技术基本知识（2）三、酶促反应动力学 酶促反应动力学主要研究酶促反应的速度以及影响反应速度的各种因素。PH值激活剂温度影响反应速度的因素抑制剂酶浓度底物浓度（一）酶促反应机制──酶－底物中间产物学说E代表酶，S代表底物，ES代表中间产物，P代表产物米－曼氏方程1913年Michaelis和Menten对中间产物学说进行数学推导，用简单的快速平衡或准平衡概念推导出了单底物的酶促反应方程式即著名的米－曼氏方程。式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数(Michaelis constant，Km)，[S]为底物浓度，V是底物S在不同浓度时的反应速度。Km是酶的特征性常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，具有重要的临床应用价值。（二）Km和Vmax的应用Km计算当V=1/2Vmax时，由米-曼方程推导出Km+[S]=2[S]，Km=[S]。鉴定酶的种类Km是酶的特征性常数之一，反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。Km和Vmax的应用反映酶和底物的亲和力Km与酶和底物的亲和力呈负相关。选择酶的最适底物当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。设计适宜的底物浓度当[S]=10Km时，V=91%Vmax，这时[S]为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。Vmax可用于酶的转化率的计算当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转化率.吸光度A非线性期延滞期线性期 t1t2 时间t 图5-1　酶促反应进程曲线四、酶促反应进程(一)酶促反应进程曲线 （二）酶促反应进程说明：1、延滞期：底物与酶结合启动反应阶段，持续时间1－3min。2、线性期（零级反应期）：最大反应速度期，是测定酶活性最佳时期，持续时间1－5min。此期反应速度与底物浓度无关，而与酶活性成正比。3、非线性期（一级反应期）：底物消耗，反应速度不与酶活性成正比，而与底物浓度成正比。（三）酶活性的概念 1、 酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。 v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。 2、酶活性单位定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1?mol底物的酶量。单位为IU/L 。Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量，1Katal=60×106IU。3、酶活性单位的计算步骤：明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位。运用公式进行计算。计算公式: 产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml）酶单位/升 = —————————×——————————×———————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml） 分光光度法测定的计算公式　 （A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间酶单位/升 = —————————×———————— ?·L·V标 实际保温时间4、酶促反应进程 酶促反应进程曲线 从酶促反应时间进程曲线可以看出，酶促反应的各期具有以下特点：1.延滞期 对单一酶促反应而言，在过量的底物存在下，底物与酶结合启动酶促反应。 2.线性期 指酶促反应速度达到并保持恒定速度进行反应的时期。此时，反应速度不受底物浓度的影响，又称零级反应期。此期酶活性与酶促反应速度成正比。3.非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性期而进入非线性期。 酶量的测定： 通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度成正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。酶促反应初速度 酶活性酶的含量5、酶促反应底物动力学中间产物学说： 酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。E + S ? ES → E + P 米-曼氏方程： Vmax〔S〕v = ——————— 〔S〕+ Km 上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。（一）米氏常数的定义由米-曼氏方程可以导出： （Vmax-v）〔S〕Km = —————————— v 当v = 1/2Vmax时，Km =