【培训课件-临床色谱质谱检验技术】_液相色谱质谱技术（三）.pptVIP

液相色谱方法建立—洗脱设置 差异项 梯度洗脱 等度洗脱 选择性（单一目标物） 很好 很好 选择性（多目标物） 很好 差 方法建立难度 较难 容易 方法稳定性 很好 较差 后流出化合物峰形 较好（可调节） 展宽 峰形重复性 较好 较差 梯度洗脱不合适带来的携带效应 携带效应 正常样品谱图 空针谱图 洗脱梯度不合适带来的携带效应—调整梯度 无携带效应 液相色谱方法建立—色谱柱的选择 色谱柱的选择—分析物 色谱柱的选择—分离目的 色谱柱质量：按照色谱柱说明书使用，尽量选择批次间质量稳定的色谱柱 色谱柱保护装置：在线过滤器（保护柱） 色谱柱性能：柱效高、寿命长、价格合理（性价比） 色谱柱的选择—其他考虑 柱寿命越长、批次间质量越稳定越好 液相色谱方法建立—色谱柱的选择 尽量选择新的色谱柱进行方法建立 液相色谱方法建立—色谱柱的选择 方法建立之初 方法验证过程中 外标法：用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液，根据峰面积和浓度做标准曲线。 内标法：准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的峰面积，计算待测组分的含量 标准加入法 液相色谱方法建立—定量分析常用方法 内标法在同步分析实验中参与从前处理到检测的全过程，因此其准确度往往显著优于外标法。 特别是在液质联用分析临床样本时，由于临床样本基质复杂，往往存在基质效应，一般采用内标法比较常见，可以消除（降低）基质效应以及回收率差异的影响，起到同步校准的作用。 内标主要分为两大类： 稳定同位素标记化合物：最理想的内标，由于物理、化学性质与待测分析物几乎相同，且结构相同 结构类似物：若没有稳定同位素标记物的情况，可以选择待测分析物的结构类似物，一般在物理化学特性上比较相似，如分子量、极性、溶解度和电离效率等 液相色谱方法建立—内标选择 检测过程中唯一存在的化合物（如它不应该是一种内源性或外源性化合物）； 内标不能与测试样本中其他具有共同碎片离子的干扰化合物一起被洗脱出来（包括可能的内源性生物标记物、药物代谢产物或源内裂解）。 液相色谱方法建立—内标选择 霉酚酸（MPA）/霉酚酸葡萄糖苷酸(MPAG) 内标需与待测分析物具有类似的理化性质、质谱行为和响应特征； 内标需与待测分析物具有相同的保留时间，理想情况下，内标应与待测分析物一起洗脱，能使定量分析中由于潜在离子增强或抑制而产生的峰分离所造成的影响降到最低。 液相色谱方法建立—内标选择 25OHD2: m/z 413.4/395.2 25OHD2-IS: m/z 419.4/401.3 25-OHD2 25-OHD2的d6标记物 液相色谱方法建立—内标选择 D6-25OHD2 D6-25OHD2 干扰 25OHD3 当使用内标存在干扰，或者使用结构类似物（如同分异构体）时作内标时，应尽可能的实现色谱分离以避免交叉干扰。 * 了解样品在流动相中的溶解度(防止其在流动相中析出)； * 防止键合相流失 * * 即使采用易挥发盐的缓冲液，应尽可能采用低浓度，在ESI过程中存在歧视效应，即离子化效率（或浓度）高的化合物的存在会抑制离子化效率（或浓度）低的化合物的离子化进程，从而使后者信号减弱甚至缺失。对于选用APCI离子化方式时，通常其离子化效率低于ESI，而对盐的耐受能力优于ESI，即使如此，也应采用低浓度缓冲盐溶液。 * 梯度洗脱的原理： 流动相由几种不同极性的溶剂组成,通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子k,并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离. * 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小); 颗粒分布越宽:柱效低; 长度: 分离度，理论塔板数; 提高柱效的途径—选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速，获得较小的塔板高度H * 常规分析柱、快速分析柱、超快速分析柱；柱长，内径；粒径；填料基质； 速率理论→范.弟姆特方程：H = A + B/u + C·u；H：理论塔板高度，u：载气流速，A：涡流扩散项；B：分子扩散；C：传质阻力 载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速?，柱效?； 载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速?,柱效? * 色谱柱的规范使用：防止堵塞，漏液，使用前未平衡好，进样量过载，在线过滤器滤芯更换等。 冲洗色谱柱，延长使用寿命；存放前的处理：除去杂质、缓冲盐；使用合适的存放溶剂及存放温度；避免机械震动； * 因此需优化色谱条件，使可能对质谱分析造成干扰的基质成分与内标分离，防止交叉干扰。 * 但当使用结构类似物（如同分异构体）时作内标时，应尽可能的实现色谱分离以避免交叉干扰。 * * 基质效应被认为主要发生在质谱的离子化步骤，来源于样品基质的非挥发性组分会改变液滴构造或液滴蒸发的效